Замена комплектующих и механизмов – Ателье мягкой мебели

Виды механизмов

 

Замена механизмов на мягкой мебели

Мебельный молдинг. Декоративные гвозди и ленты.

Вид	Описание
	Декоративная лента с гвоздями, длина 1 метр. Диаметр 9,6 мм Цвет латунь
	Декоративные гвозди для мебели, длина 1 метр. Диаметр 9,6 мм Цвет старое золото
	Гвозди мебельные декоративные, длина 1 метр. Диаметр 11,3 мм Цвет старое золото
	Молдинг для мебели, длина 1 метр. Диаметр 9,6 мм Цвет латунь ренессанс
	Декоративный молдинг для мебели, длина 1 метр. Диаметр 11,3 мм Цвет латунь ренессанс
	Декоративная лента с гвоздями, длина 1 метр. Диаметр 11,3 мм Цвет латунь

На сегодняшний день существует несколько основных видов механизмов диванной трансформации, среди которых самым прочным и надежным считается «книжка». Идея «книжки» проста, как все гениальное: минимум сложностей в конструкции – минимум возможностей для поломки. Механизмы «клик-кляк» и «аккордеон» также являются разновидностью «книжки», просто более поздней. Чаще всего ремонт подобного рода механизмов сводится к подкручиванию болтов и смазыванию гаек.

Следующий по популярности и распространенности механизм трансформации носит название «раскладушка». Он бывает двойным, тройным, «французским», «американским», на деревянных латах или на сварной решетке. Основная проблема таких механизмов – это пластиковые латодержатели, которые довольно часто ломаются.

Существуют также выкатные механизмы, принцип действия которых основан на работе нескольких колесиков, стропов, направляющих и поворотных шарниров. С такими механизмами, как правило, больше всего трудностей, так как они состоят из множества мелких деталей, и в случае поломки одной из них, замене подлежит весь комплект.

Согласитесь, совершенно нерентабельно отказывать от любимого кресла или насиженного дивана только потому, что у него сломался механизм трансформации, ножка, подлокотник или вышли из строя другие комплектующие. Гораздо проще, удобнее и, что самое главное, дешевле обратиться к мастеру по ремонту мягкой мебели, чтобы он произвел замену вышедших из строя деталей и механизмов. Чтобы Ваш любимый диван снова стал «как новенький», можно ограничиться заменой старых комплектующих на новые аналоги, а можно кардинально поменять облик любимого предмета интерьера и заказать принципиальную замену способа трансформации.

Замена комплектующих и механизмов

Хотите уточнить стоимость?
Заполните форму, и мы вам перезвоним!

Ремонт дивана клик-кляк в Москве

Закажите недорогой профессиональный ремонт дивана клик-кляк у специалистов, зарегистрированных на YouDo. Опытные мебельщики принимают заявки на ремонт механизма дивана клик-кляк круглосуточно и без выходных, поэтому вы можете заказать выезд мастера в удобное для вас время.

Вызов специалиста возможен в любую точку Москвы и городов ближнего Подмосковья. Ремонт внутридиванной конструкции выполняется с использованием проверенных запасных деталей, поэтому после замены механизма типа клик-кляк раскладные диваны служат еще много лет.

Услуги по реставрации мягкой раскладной мебели

Если вам нужно срочно отремонтировать неисправные механизмы дивана типа клик-клак, закажите выезд на дом частного специалиста, зарегистрированного на Юду. Опытный мебельщик сможет быстро починить или заменить механизмы раскладной мебели в Москве, а также окажет следующие услуги:

• перетяжку дивана клик-кляк с обивкой из ткани и кожи
• замену пружинных блоков
• реставрацию каркаса
• ремонт диванов с механизмами других типов

Качественный и недорогой ремонт диванов клик-кляк на дому мастерами, зарегистрированными на YouDo, выполняется максимально оперативно.

Основные поломки внутридиванной конструкции

Частные мебельщики, зарегистрированные на Юду, могут недорого отремонтировать диваны любой конструкции сложения, а также починить все виды мягкой раскладной мебели по минимальным расценкам в Москве и Московской области. Профессиональный мебельный мастер выполнит все виды работ по ремонту качественно. Вызывайте на дом опытного специалиста, если нужно устранить следующие поломки мягкой мебели:

• выход из строя трансформирующей конструкции
• неисправность и деформация пружин
• выход из строя каркаса диванов
• деформация ламелей, ремней

Мастера, зарегистрированные на YouDo, быстро заменят механизмы трансформации клик-кляк, обивочную ткань и пружины мягкой мебели. Заказывайте их услуги на самых выгодных для вас условиях.

Стоимость услуг мебельных мастеров

Исполнители Юду выполняют все виды работ по реставрации и восстановлению конструкций мягкой мебели по доступным расценкам. Посмотрите тарифы специалистов на отдельные работы в прейскуранте. Точная стоимость реставрации мебели рассчитывается с учетом таких параметров, как:

• тип мебели
• тип конструкции сложения
• вид услуг
• объем и сложность работ
• цена на запасные детали, расходные материалы

Окончательная стоимость работы профессиональных мебельщиков определяется в индивидуальном порядке. Ориентируясь на расценки в прайсе, вы можете указать собственную цену при создании индивидуального задания. В этом случае на вашу заявку ответят специалисты, готовые починить мебель на указанных условиях. Вам останется выбрать мастера, который сделает ремонт дивана клик-кляк по самой низкой цене.

Ремонт дивана клик-кляк – быстро и недорого

Что такое диван клик-кляк?

Отличие данной модели мебели от других заключается в особенности конструкции и механизме трансформации. В основе заложен каркас из стали, деревянные латы и спинка. Название клик-кляк диван получил из-за принципа механизма конструкции. При трансформации, после поднятия кверху сиденья спинка сама приходит в движение, и опускается в нужное положение. Однако даже такие, казалось бы, надежные модели со стальным каркасом иногда нуждаются в ремонте.

Что ремонтируется у дивана клик-кляк?

Чаще всего ремонт диванов клик-кляк, заключается в замене обшивочного материала и подложек, которые находятся под обшивкой. И хотя механизм у данных изделий отличный, но при некачественной обивке дешевым материалом очень скоро пользователь начинает ощущать на своем теле элементы этого механизма (внутренних пружин и прочего). Терпеть такое не захочет никто, да и о каком отдыхе тут может идти речь. Поэтому тут нужен ремонт диванов клик-кляк в любом случае. Сделать его можем и мы, потому как специализируемся на таких услугах. Обновление вашей мебели обойдется вам недорого, а вот результат превзойдет самые смелые ожидания.

Что мы делаем?

Руками наших мастеров выполняются многие работы по качественной перетяжке любой мебели. Также мы делаем ремонт диванов клик-кляк любых габаритов. К вашим услугам оперативная перетяжка обивки, замена частей изломов и смена одного вида ткани обивки на другой. К нам часто обращаются со всевозможными проблемами, поэтому наш опыт позволяет выполнить любые работы максимально качественно.

Отзывы

Каждый ремонт — это отдельный случай, и стоимость зависит от многих параметров:
сложности и трудозатрат, стоимости материалов, места проведения ремонта и
габаритов мебели. Здесь мы приводим примерную стоимость, а также вы можете
воспользоваться нашим калькулятором.

Заказывала перетяжку кухонного дивана замысловатой и довольно неудобной в работе конфигурации. Занялась этим по настоянию членов семьи — сама бы предпочла купить новый. Теперь вижу: никакого нового не надо, мастер образцово выполнил обивку.

Елена, декабрь 2017

Выражаю благодарность за работу мастера Алексея и постоянную поддержку со стороны Сергея. Быстро и очень качественно перетянули часть дивана, которая катастрофически пострадала от острых когтей и зубов любимого домашнего питомца.

Наталия, ноябрь 2017

Большое спасибо Александру за быструю и качественную обивку моего дивана. Теперь он лучше нового. Отличная работа!

Галина, август 2017

ЗАО «Центральная поликлиника Литфонда» благодарит коллектив ООО «Франч-Гид» за профессиональное выполнение работ по ремонту мебели. Ремонт мебели произведен качественно и оперативно. Благодарим за совместное сотрудничество.

ЗАО «ЦЕНТРАЛЬНАЯ ПОЛИКЛИНИКА ЛИТФОНДА», апрель 2017

В июле 2016 года МАОУ «Средняя школа №6» обратилась в компанию Профремонтмебели мебели за услугой по перетяжке мебели.
Спасибо организации за оперативность.

МАОУ «СРЕДНЯЯ ШКОЛА №6», февраль 2017

Закажите ремонт мебели сейчас

Мы готовы выехать к вам для подбора материалов, оценки стоимости и самого
ремонта уже завтра. Просто оставьте заявку и мы с вами свяжемся.

Все наши услуги

(Используйте прокрутку для просмотра блока)

Механизм клик кляк ремонт | Домострой

г. Москва ул. Тверская, дом 6, офис 202

200 от м. Театральная

8 (499) 403 32 35

Время работы с 7:00 до 23:00 (без выходных)

Ремонт дивана Клик Кляк и Тик -Так

Механизма и Каркаса на деревянном и

на металлическом каркасе

Любой Сложности на Дому

Более 3000 довольных клиентов

Возможная причина неисправности

При раскладывании или складывании дивана возникают заедания или заклинило.

Деформации в диване:

— возможно сломан брусок, треснула ДВП, фанера, ДСП внутри рамы

Производится замена изношенных механизмов трансформации на новые.

Столярный ремонт поврежденных элементов.

от 3 месяцев до 2 лет

Ремонт и Замена Механизмов Диванов

Отремонтировать дешевле чем приобретать новое!

Сломались держатели дивана, его механизм перестал правильно функционировать?

Сломались держатели дивана, его механизм перестал правильно функционировать? Есть решение проблемы: приобрести новый диван или отремонтировать старый. Ремонт диванов в Москве обойдется дешевле, чем их замена. Если работа выполнена качественно, то отремонтированный диван не будет отличаться от только приобретенного.
Мастера нашей компании качественно и в срок выполнят Ремонт Механизма Дивана Книжка на металлическом или деревянном каркасе. Устранят проблемы с раскладыванием/складыванием дивана отремонтируют и заменят внутридиванные раскладушки, заменят комплектующие: латы, латодержатели,произведут столярные работы по Усилению каркаса дивана,отремонтируют ножки дивана. В число столярных работ входит Ремонт Каркаса Дивана, Ремонт Бельевого ящика , замена панелей, брусков, ДСП на фанеру. Ремонт диванов в Москве осуществляется на дому у заказчика. При выезде к клиенту у наших специалистов есть все необходимые инструменты.

Наши специалисты приедут на место, произведут диагностику и отремонтируют диван.Если возникает необходимость заменить некоторые детали или фурнитуру — наши мастера помогут приобрести и доставить всё необходимое для ремонта. Косультации Бесплатно! Предоставляем гарантию на все выполненные ремонтные работы.Приезд мастера в удобное для заказчика время.Работаем без выходных.

В компании действует система скидок.Вы можете прислать фото поломки нам на почту .

Несмотря на то, что диваны-книжки и кресла-кровати используются уже достаточно давно, с некоторых пор подъемное устройство было усовершенствовано. Механизм клик-кляк, как его назвали изобретатели из Франции, является достаточно инновационным, и, при этом, исключительно удобным.

Вот как такая мебель выглядит в интерьере

Описание и некоторые особенности

Стандартный диван с механизмом клик кляк имеет несколько составных частей:

1. Спинка, усиленная конструктивными элементами из древесины.
2. Стальной каркас, предназначенный для сидения.

Это конструктивные элементы и соединяет механизм трансформации клик кляк. При этом составные части дивана используют в качестве точки опоры верхнюю часть ящика, который предназначен для хранения белья и других постельных принадлежностей.

На заметку! Само название произошло от имитации звука, который напоминает двойной щелчок («клик» и «кляк») при трансформации из кровати в диван и наоборот.

Кстати, сам мебельный ящик, как правило, изготавливается из достаточно прочной древесины, либо из ламинированного ДСП, что дает гарантию его длительного использования и позволяет выдерживать достаточно большие нагрузки. Объем же этого ящика позволяет хранить внутри него практически все необходимое белье.

Как происходит фиксирование

Давайте скажем несколько слов о том, как работает механизм клик кляк. Устройство, на самом деле, достаточно простое и его принцип работы заключается в следующем. Для того, чтобы разложить диван, вам понадобится поднять вверх сиденье. Спинка постепенно опускается вниз, и при достижении горизонтального положения она попадает прямиком на отделение для белья. При этом, сам верх сиденья будет двигаться дальше, способствуя сокращению угла со спинкой дивана.

Если говорить о щелчках, то нужно отметить, что есть третье положение, которого нет в обычных диванах, является промежуточным. Если вы услышите первый щелчок, то знайте: механизм клик-кляк был переведен фиксатор в положение, которое предназначено для расслабленного и спокойного отдыха. Если же начинать опускать сиденье, то сам фиксатор будет стабильно оставаться в промежуточном положении. Таким образом, диван-кровать можно будет использовать для того, чтобы отдыхать в полулежащем и полусидящем положении.

Как работает механизм клик кляк, видео:

Когда, услышав первый щелчок, вы продолжите подъем сиденья, скоро услышите повторный звук. Он будет означать, что механизм фиксации освободил фиксатор, который более не сдерживается. Таким образом, получается, что спинка остается в горизонтальном положении. Само же сиденье можно опускать до тех пор, пока оно не поравняется в один уровень со спинкой. Таким образом, вы сможете использовать получившуюся прямую кровать и ровную для сна, поскольку на ней можно будет лежать, находясь в горизонтальном положении.

Если говорить про обратную трансформацию, то все происходит примерно так же, с той лишь разницей, что второй щелчок на сей раз будет сигнализировать о том, что диван можно трансформировать в положение «сидя», поскольку фиксатор удерживается в самом крайнем положении. Теперь вы будете в общих чертах в курсе того, как работает это устройство.

Внимание! Ряд моделей имеют боковые аналоги подлокотников, которые также можно трансформировать в положение спинки или сиденья.

Основные плюсы и минусы

Как свидетельствуют практика, в также отзывы о механизме клик-кляк, он имеет как преимущества, так и определенные недостатки. Вот главные плюсы:

1. Конструкция с опорой на ящик для постельных принадлежностей получается исключительно прочной и надежной. Устройство таково, что ящик для белья, при этом, является очень вместительным.
2. Благодаря особенностям работы механизма появляется возможность создания идеально ровной поверхности для сна. В тому же, она отлично подходит для использования ортопедического матраса.

Тем не менее, нельзя сказать и про главный минус. Речь идет про определенное свободное место между стеной и спинкой диван, которое требуется для того, чтобы раздвинуть его. Поэтому вам может понадобиться постоянно двигать диван-кровать, то к стене, то от стены. Либо смириться с промежутком на то время, пока диван-кровать будет находиться в положении для сидения.

Схема раскладывания и складывания, поэтапно

С другой стороны, речь идет о более старой версии механизма клик-кляк. Более новые экземпляры, производство которых осваивают ведущие заводы-изготовители, лишены этой проблемы, поскольку при трансформации он смещается в сторону стены.

Главные моменты в ремонте и эксплуатации

А теперь – несколько слов о том, как надо проводить эксплуатацию и ремонт механизма клик-кляк. Первым делом, вам необходимо помнить про то, что такой механизм должен быть смазан. Дело в том, что именно отсутствие смазки, как правило, является причиной поломок, после которых приходится делать ремонт механизма клик кляк своими руками. Дело в том, что при отсутствии смазки, при трансформации между металлическими частями постепенно образовывается люфт, который приводит к неправильной работе и поломкам.

Совет! Смазывайте механизм, используя для этого специальную смазку или густое масло, предназначенное для технических работ.

Кстати, перед тем, как наносить смазку необходимо чем-то накрыть ящик для постельных принадлежностей, чтобы он не испачкался. Смазывать необходимо как центральную часть, так и места соединения сиденья с ящиком для белья.

Если диван сломался, то вы можете узнать, как починить подъемный механизм трансформации клик кляк, (видео):

Еще одна поломка, после которой может понадобиться небольшой ремонт, связана с тем, что одна из частей механизма застряла в том положении, которое предназначено для сна. При этом вы можете слышать типичные щелчки лишь с одной стороны. Безусловно, сам диван при этом продолжит раскладываться, однако по причине повышенной нагрузки на одну часть, достаточно скоро может произойти ее поломка.

Кстати! Для лучшей сохранности самой отделки вполне допустимо использовать дополнительный чехол.

Вы можете попробовать починить такую неисправность, смазав проблемное место смазкой. Однако в том случае, если это не помогло, вам придется полностью заменить парный механизм. При этом, замена требуется сразу обеим частям. В то же время, в большинстве случаев ремонт механизма клик-кляк вам не понадобится: при бережной и аккуратной эксплуатации такой диван прослужит очень долго и не доставит лишних проблем.

Примеры фото в интерьере (нажмите для увеличения):

Ремонт диванов на дому в Москве, замена и ремонт механизмов, диванных раскладушек, перетяжка, ремонт каркасов диванов, сварочные работы.

Выезжаем по Москве и Московской Области.

Цены на ремонт ТУТ

• Ремонт деревянных каркасов

  Перетяжка из ткани в кожу

  Сварка металлических каркасов раскладушек

  Замена французских раскладушек

  Изготовление матрасов для диванов

  Установка раскладушки в не раскладные диваны

  Химчистка диванов

  Матрасы для американских раскладушек

  Ремонт и замена раскладушек

  Пришлите фото проблемы на электронную почту filmebel@yandex. ru Viber/WhatsApp +7-925-170-65-93 и мы поможем Вам быстрее, чем если Вы просто позвоните. Выезжаем к клиенту сразу для ремонта, а не «посмотреть».

  Мы выполняем работы по ремонту мягкой мебели и диванов с 2005 года. Мастера москвичи с многолетним опытом работы, оснащенные всем необходимым инструментом и запчастями.

  Все работы по ремонту диванов, кроме перетяжки, сварки и особо сложных случаев производятся на дому у заказчика в удобное время, в том числе в вечернее время. Для выполнения сложных и трудоёмких ремонтных работ диван, либо его часть могут быть вывезены в мастерскую нашим транспортом.

  Посетите нашу страницу в Инстаграм www.instagram.com/filmebel/

  Работы выполняемые нашими мастерами:

  Ремонт и замена механизмов диванов на дому.

  Ремонт механизмов дивана книжка, аккордеон, клик кляк, дельфин, выкатной, еврокнижка с выездом на дом по Москве и Московской Области.

  Замена механизмов сложения (трансформации) раскладных и выкатных диванов.

  Ремонт диванов с раскладушкой, замена и ремонт диванных раскладушек любого типа на дому за 1-2 часа.
  Замена лат и латодержателей в металлических трансформерах и диванных раскладушках

  Новые матрасы для французских и американских раскладушек

  Переделка спального места дивана для установки внутридиванной французской и американской раскладушки. Работы выполняются на дому и с вывозом в мастерскую.

  Ремонт мягкой мебели на дому и в мастерской.

  Ремонт мягкой мебели — замена тканевой и кожаной обшивки, раскладушек, замена поролона, ремонт механизмов в мягкой мебели. Замена пружинного блока на качественный наполнитель из пенополиуретана. Выполняем работы в Москве и Области.

  Реставрация диванов в Москве на дому и с вывозом.

  Реставрация диванов, замена обивки, обновление лакового покрытия, замена механизмов в диванах и раскладушках, реставрация каркасов диванов,

  Ремонт и укрепление каркасов, замена брусков, фанеры, роликов, пружин в диване.

  Сварка металлических каркасов диванов.

  Профессиональная сварка и ремонт металлических каркасов диванов и диванных раскладушек с вывозом в мастерскую.

  Замена и ремонт деталей каркасов диванов, решеток, поперечных труб и профилей.

  Качество и долговечность выше, чем у производителя. Мы не экономим на материалах. Гарантия до 1 года.

  Ремонт диванов ИКЕА в Москве.

  Замена механизмов сложения диванов ИКЕА, диванных раскладушек, ремонт и сварка каркасов раскладушек, замена обивки дивана.
  Ремонт металлокаркасов раскладных диванов ИКЕА — ремонт тяг, замена поперечин в каркасе, сварочные работы по каркасу.
  Качество выше, чем у производителя. После ремонта диван лучше, чем новый.

  Ремонт дивана 8 Марта, Британика ( Britannica) в Москве.

  Ремонт дивана Британика, 8 Марта, ремонт раскладушки в диване, замена раскладушки на новую, матрасы Люкс, замена обивки, перетяжка дивана в кожу и ткань.

  Огромный опыт работы по ремонту диванов фабрики Британика и 8 Марта со встроенной раскладушкой. Отработанные технологии. Высокое качество работ.
  Новые, более надежные раскладушки и матрасы. Гарантия на все виды работ и механизмы.

  Ремонт кресел, ремонт стульев, ремонт пуфов и банкеток.

  Ремонт кресел, стульев, банкеток, пуфиков в нашей мастерской.

  Ремонт и склейка деревянных каркасов кресел, стульев, банкеток, пуфов.

  Ремонт проломленного днища и замена его на фанеру.

  Замена поролона в сиденье, обивка и перетяжка новой тканью.

  Ремонт диванов аккордеон на дому в Москве.

  Ремонт дивана аккордеон на металлическом и деревянном каркасе, замена механизмов сложения, матрасов, обивки, ремонт каркаса дивана аккордеон.

  Пошив чехлов для диванов аккордеон на металлическом каркасе.

  Изготовление качественных пенополиуретановых матрасов для диванов аккордеон.

  Ремонт диванов книжка на дому в Москве.

  Ремонт дивана книжка на металлическом и деревянном каркасе, замена механизмов сложения, матрасов, обивки, ремонт каркаса дивана книжка. Пошив чехлов для диванов книжка на металлическом каркасе.
  Изготовление качественных матрасов для диванов книжка.

  «>

Механизм клик кляк: устройство для трансформации дивана

Несмотря на то, что диваны-книжки и кресла-кровати используются уже достаточно давно, с некоторых пор подъемное устройство было усовершенствовано. Механизм клик-кляк, как его назвали изобретатели из Франции, является достаточно инновационным, и, при этом, исключительно удобным.

Вот как такая мебель выглядит в интерьере

СодержаниеРаскрыть

Описание и некоторые особенности

Стандартный диван с механизмом клик кляк имеет несколько составных частей:

1. Спинка, усиленная конструктивными элементами из древесины.
2. Стальной каркас, предназначенный для сидения.

Это конструктивные элементы и соединяет механизм трансформации клик кляк. При этом составные части дивана используют в качестве точки опоры верхнюю часть ящика, который предназначен для хранения белья и других постельных принадлежностей.

На заметку! Само название произошло от имитации звука, который напоминает двойной щелчок («клик» и «кляк») при трансформации из кровати в диван и наоборот.

Кстати, сам мебельный ящик, как правило, изготавливается из достаточно прочной древесины, либо из ламинированного ДСП, что дает гарантию его длительного использования и позволяет выдерживать достаточно большие нагрузки. Объем же этого ящика позволяет хранить внутри него практически все необходимое белье.

Как происходит фиксирование

Давайте скажем несколько слов о том, как работает механизм клик кляк. Устройство, на самом деле, достаточно простое и его принцип работы заключается в следующем. Для того, чтобы разложить диван, вам понадобится поднять вверх сиденье. Спинка постепенно опускается вниз, и при достижении горизонтального положения она попадает прямиком на отделение для белья. При этом, сам верх сиденья будет двигаться дальше, способствуя сокращению угла со спинкой дивана.

Читайте также про аналог под названием «Седафлекс».

Если говорить о щелчках, то нужно отметить, что есть третье положение, которого нет в обычных диванах, является промежуточным. Если вы услышите первый щелчок, то знайте: механизм клик-кляк был переведен фиксатор в положение, которое предназначено для расслабленного и спокойного отдыха. Если же начинать опускать сиденье, то сам фиксатор будет стабильно оставаться в промежуточном положении. Таким образом, диван-кровать можно будет использовать для того, чтобы отдыхать в полулежащем и полусидящем положении.

Как работает механизм клик кляк, видео:

Когда, услышав первый щелчок, вы продолжите подъем сиденья, скоро услышите повторный звук. Он будет означать, что механизм фиксации освободил фиксатор, который более не сдерживается. Таким образом, получается, что спинка остается в горизонтальном положении. Само же сиденье можно опускать до тех пор, пока оно не поравняется в один уровень со спинкой. Таким образом, вы сможете использовать получившуюся прямую кровать и ровную для сна, поскольку на ней можно будет лежать, находясь в горизонтальном положении.

Если говорить про обратную трансформацию, то все происходит примерно так же, с той лишь разницей, что второй щелчок на сей раз будет сигнализировать о том, что диван можно трансформировать в положение «сидя», поскольку фиксатор удерживается в самом крайнем положении. Теперь вы будете в общих чертах в курсе того, как работает это устройство.

Внимание! Ряд моделей имеют боковые аналоги подлокотников, которые также можно трансформировать в положение спинки или сиденья.

Основные плюсы и минусы

Как свидетельствуют практика, в также отзывы о механизме клик-кляк, он имеет как преимущества, так и определенные недостатки. Вот главные плюсы:

1. Конструкция с опорой на ящик для постельных принадлежностей получается исключительно прочной и надежной. Устройство таково, что ящик для белья, при этом, является очень вместительным.
2. Благодаря особенностям работы механизма появляется возможность создания идеально ровной поверхности для сна. В тому же, она отлично подходит для использования ортопедического матраса.

Тем не менее, нельзя сказать и про главный минус. Речь идет про определенное свободное место между стеной и спинкой диван, которое требуется для того, чтобы раздвинуть его. Поэтому вам может понадобиться постоянно двигать диван-кровать, то к стене, то от стены. Либо смириться с промежутком на то время, пока диван-кровать будет находиться в положении для сидения.

Схема раскладывания и складывания, поэтапно

С другой стороны, речь идет о более старой версии механизма клик-кляк. Более новые экземпляры, производство которых осваивают ведущие заводы-изготовители, лишены этой проблемы, поскольку при трансформации он смещается в сторону стены.

Главные моменты в ремонте и эксплуатации

А теперь – несколько слов о том, как надо проводить эксплуатацию и ремонт механизма клик-кляк. Первым делом, вам необходимо помнить про то, что такой механизм должен быть смазан. Дело в том, что именно отсутствие смазки, как правило, является причиной поломок, после которых приходится делать ремонт механизма клик кляк своими руками. Дело в том, что при отсутствии смазки, при трансформации между металлическими частями постепенно образовывается люфт, который приводит к неправильной работе и поломкам.

Совет! Смазывайте механизм, используя для этого специальную смазку или густое масло, предназначенное для технических работ.

Кстати, перед тем, как наносить смазку необходимо чем-то накрыть ящик для постельных принадлежностей, чтобы он не испачкался. Смазывать необходимо как центральную часть, так и места соединения сиденья с ящиком для белья.

Если диван сломался, то вы можете узнать, как починить подъемный механизм трансформации клик кляк, (видео):

Еще одна поломка, после которой может понадобиться небольшой ремонт, связана с тем, что одна из частей механизма застряла в том положении, которое предназначено для сна. При этом вы можете слышать типичные щелчки лишь с одной стороны. Безусловно, сам диван при этом продолжит раскладываться, однако по причине повышенной нагрузки на одну часть, достаточно скоро может произойти ее поломка.

Кстати! Для лучшей сохранности самой отделки вполне допустимо использовать дополнительный чехол.

Вы можете попробовать починить такую неисправность, смазав проблемное место смазкой. Однако в том случае, если это не помогло, вам придется полностью заменить парный механизм. При этом, замена требуется сразу обеим частям. В то же время, в большинстве случаев ремонт механизма клик-кляк вам не понадобится: при бережной и аккуратной эксплуатации такой диван прослужит очень долго и не доставит лишних проблем.

Примеры фото в интерьере (нажмите для увеличения):

Замена и ремонт механизмов мебели в Санкт-Петербурге (СПБ): цены, отзывы, фото, стоимость

Наша компания предлагает профессиональный ремонт и замену механизмов мебели. Квалифицированные мастера быстро и недорого выполнят ремонт, отрегулируют механизм и восстановят его функции.

Заказать замену трансформационной системы для дивана легко. Услуги будут оказаны в кратчайшее время, для работы применяются качественные комплектующие от ведущих производителей мебели. Мы предлагаем самые низкие цены в СПб.

 

Механизм Книжка 

Самый распространенный и простой. Для разборки дивана в кровать надо аккуратно поднять сиденье и потянуть на себя, при этом будет слышен характерный щелчок. Для сборки эти действия повторяются в обратном порядке. При ежедневном использовании подвижные части дивана могут выйти из строя, тогда потребуется помощь специалистов. 

Предлагаем воспользоваться услугами нашей компании. Все работы будут выполнены в кратчайшее время на дому у заказчика (по желанию). Услуги осуществляются с использованием качественных комплектующих с гарантией.

Система «книжка» обладает многочисленными преимуществами. Это большой бельевой ящик под сиденьем, комфортабельное спальное место, возможность установки классического пружинного блока. 

Замена выкатного механизма

Наша компания предлагает профессиональный и недорогой ремонт выкатного механизма для угловых и линейных диванов. Выкатная система отличается практичностью и простотой в использовании, для разборки кровати надо только потянуть сиденье на себя до упора.

Подобная система может дать сбой. Обычно починки требуют салазки или ролики, также может быть необходима регулировка высоты выкатного элемента.

У нас вы можете заказать ремонт выкатных механизмов для диванов по самым низким ценам. Все работы будут выполнены на дому у заказчика в кратчайшие сроки с использованием высококачественных комплектующих.

 Еврокнижка 

Диван «еврокнижка» является оптимальным вариантом для ежедневного использования. Разобрать мебель просто. Для этого сиденье выдвигается на себя, а на его место опускается спинка. Со временем система требует регулировки или замены.

Мы предлагаем профессиональный ремонт диванов с трансформационными системами «еврокнижка». Наши услуги обойдутся недорого, все работы будут выполнены в срок с использованием качественных комплектующих.

«Еврокнижка» – практичный и надежный механизм, который при правильной эксплуатации прослужит не один год. Закажите у нас установку, замену или ремонт трансформационных систем по самым выгодным ценам и с гарантией качества.

Дельфин (микролифт) 

Трансформационный механизм «дельфин» часто используется в угловых диванах. Он надежен, прост в использовании и предназначен для частой эксплуатации. Для разборки кровати надо выкатить секцию дивана из-под сиденья и тянуть ее на себя, пока спальное место будет не разобрано до конца.

Из преимуществ системы – ровное и просторное спальное место, наличие ящика для белья в угловом элементе. Но производитель часто используют тонкий беспружинный наполнитель, что мешает полноценному отдыху. Кроме того, подобный диван сложно разбирать на ковровом покрытии.

У нас можно заказать замену или ремонт системы «дельфин» недорого. 

Аккордеон 

Предлагаем ремонт или замену механизма «аккордеон» по самым выгодным ценам. Все работы будут выполнены в кратчайший срок, недорого и на дому у заказчика. В работе используются только качественные комплектующие, заказчику предоставляется гарантия.

Трансформация «аккордеон» проста, работает по принципу гармошки, комфортна в использовании. Такой диван в собранном виде компактен, но в разобранном требует много места, что надо учитывать при покупке. Ремонт подобной системы требуется крайне редко.

Клик-Кляк 

Разновидность классической «книжки», предусматривающий несколько положений разборки, включая «релакс». Механизм простой и ровный в работе, но при трансформации его нужно передвигать, а это может стать причиной поломки.

Наша компания предлагает ремонт диванов «клик-кляк» недорого. Профессиональная замена системы трансформации выполняется в кратчайшие сроки с использованием качественных комплектующих.

 

Прайс-лист на услуги по перетяжке, обивке мебели 

Внимание. Стоимость материалов расчитываются отдельно. В данной таблице указаны цены за работу.

Предмет	Цена	Предмет	Цена
Матрац	от 1200 р.	Кресло-кровать	от 2000 р.
Диван-книжка	от 2500 р.	Стул	от 350 р.
Диван-еврокнижка	от 3000 р.	Стул со спинкой	от 500 р.
Диван-двухместный	от 3500 р.	Обивка дверей	от 2000 р.
Диван-трёхместный	от 4000 р.	Декоративные панели на дверь	от 3500 р.
Диван-два кресла	от 8000 р.	Декоративные панели на стену	от 2000 р.
Угловой диван	от 5000 р.	Изголовья для кровати	от 3500 р.
Кухонный уголок	от 2000 р.	Реставрация мебели	Договорная
Тахта	от 2000 р.	Реставрация декоративной мебели	Договорная
Евро-тахта	от 3000 р.	Перетяжка прочей мебели	Договорная
Кресло	от 1300 р.	Ремонт мебели	По запросу

 

 

 

Вас также может заинтересовать:

Замена механизмов дивана

Замена механизмов дивана

Наша компания предоставляет услуги по замене механизмов диванов, кресел и прочей мебели любой сложности.

Замена механизма производится как “на месте” так и у нас в мастерской. 

Виды складных механизмов диванов, которые мы ремонтируем:

Диван «Книжка»

Чаще всего из строя выходит направляющая планка, которая прикреплена к каркасу – заклепки из-за повышенного давления рассыпаются. Если отверстие под них не имеет механической деформации, сама деталь находится в удовлетворительном состоянии, достаточно подобрать подходящий крепеж. Своими руками эту операцию выполнить очень сложно – ошибка в длине заклепки приведет к тому, что механизм не станет на свое место (выступающая часть заклепки затруднит сборку). В отличие от многих других типов мебели, такой ремонт механизмов мягкой мебели выполняется без затруднений на дому.

«Французская раскладушка», «Дельфин»

Легкие поломки в таких изделиях устраняются за несколько часов – наиболее распространенной проблемой является растяжение пружин, износ крепежей. Однако, если производитель не позаботился о достаточной толщине каркаса для механизма трансформации, возможно появление трещин. Восстановлению она не подлежит, так как мастер не может гарантировать ее надежность и долговечность. Мы выполним полную замену системы раскладывания.

«Клик-кляк»

Такой диван имеет самую слабую и проблемную конструкцию – она получает самую большую нагрузку, металлические элементы очень быстро начинают гнуться и лопаются. Произвести локальный ремонт механизма «клик-кляк» невозможно, нужна замена механизма. В дальнейшем рекомендуется бережная эксплуатация и регулярная (один раз в 9-12 месяцев) смазка соединительных деталей.

«Выкатной», «Подъемный», «Аккордеон»

Эти типы трансформации имеют много мелких деталей, которые быстро изнашиваются. В выкатных моделях из строя выходят ролики – они должны беспрепятственно скользить по поверхности, но пластиковое колесико ломается, крепеж разбалтывается, упирается в канавку и разрушает ее. Игнорирование проблемы спровоцирует деформацию каркаса. Если заменить деталь сразу, ремонт ограничится покупкой нового ролика.

Типы механизмов дивана-кровати

Вы когда-нибудь ночевали на бюджетном диване-кровати? Отложить на всю жизнь?

Диваны-кровати, если они сделаны хорошо, должны быть чем-то, чем можно наслаждаться долгие годы. Диван-кровать Made to Last гарантированно прослужит вам до 15 лет и более.

При низком качестве дивана-кровати матрас через несколько лет начинает провисать. Механизм, открывающий диван-кровать, также ослабевает и начинает изнашиваться, из-за чего его труднее открывать и становится менее поддерживающим. То, что когда-то казалось выгодной сделкой, может в конечном итоге оказаться довольно значительным вложением в мебель, которая прослужит всего пару лет.

В этом посте рассказывается о трех типах механизмов диванов-кроватей, которые мы используем, и их характеристиках.

Если вы много знаете о компании Made to Last, то вы поймете, что наша основная цель – предоставить вам продукты с наилучшим соотношением цены и качества – это означает, что самый дешевый в долгосрочной перспективе .

Диван-кровать должен быть удобным сиденьем для вас или для гостей, сидеть, работать или отдыхать. Это тоже гостевая кровать. Если вы живете в небольшом доме, это еще более важно.Он должен выдерживать ночное использование. Вот почему мы разработали все наши диваны-кровати, чтобы они могли выдерживать повседневное использование.

В любом случае диван-кровать должен выдержать испытание временем. Если вы хотите найти качественный диван-кровать, ключевыми факторами являются механизм открывания, качество изготовления матраса, конструкция каркаса, материалы подушек и их конструкция, а также ткань, использованная для его обивки, и, конечно же, качество изготовления. проектирование и производство вашего продукта.

Все наши диваны-кровати оснащены прочными механизмами, которые не ослабнут, не прогнутся и не сломаются. Кроме того, наши матрасы толще и изготовлены более тщательно, чем у многих других брендов. который обеспечит вам комфортный ночной сон.

Наша фабрика начала свою деятельность как производитель матрасов более 40 лет назад, а затем около 20 лет назад перешла на производство мягкой мебели. Вот почему мы уверены, что на всех наших диванах-кроватях у нас есть матрас, ведущий на рынке.

В любом случае – я отвлекся, этот пост посвящен механизму дивана-кровати.

Три типа механизмов открывания дивана-кровати

Диван-кровать имеет один из трех основных механизмов открывания. Это стандартный выдвижной механизм, механизм легкого открывания и щелчок. На нашем сайте мы предлагаем все три стиля. Каждый из них имеет уникальные преимущества, а модели бренда Made to Last обладают дополнительным преимуществом – самый толстый матрас на рынке.

Выдвижной диван-кровать

Выдвижной диван-кровать – модель, которую вы видели в течение многих лет. Это самая распространенная модель, которая считается отраслевым стандартом.И это стандарт не зря. Его легко установить и убрать. Удачно названный, выдвижной диван-кровать делает именно то, что следует из названия. Вы тянете каркас матраса вперед, чтобы открыть кровать.

Как работает механизм вытягивания?

Раскладывать кровать очень просто. Сначала снимите с дивана верхние подушки. Затем вы увидите подпружиненный металлический каркас. Матрас складывается снизу на три части.

Механизм выдвижения дивана-кровати фото

Чтобы открыть кровать, потяните каркас из центра.Пара ножек опускается и складывается на место. Разверните остальную часть матраса, второй комплект ножек раскладывается, и все готово.

Механизм выдвижного дивана

Сделано для последней Выдвижной диван-кровать

Большинство выдвижных кроватей имеют тонкий матрас – это связано с более компактным и дешевым механизмом, а также, конечно, с матрасом с гораздо меньшим комфортом.

Мы разработали рамы наших диванов-кроватей на несколько сантиметров больше, чтобы они могли удерживать более крупный механизм с более толстым матрасом.

Мы все знаем, каково это – спать на вытяжке и чувствовать штангу на спине. Диваны-кровати не Made to Last! Все наши выдвижные модели поставляются с толстым и поддерживающим 14-сантиметровым полностью пружинным матрасом. У вас всегда будет возможность заменить его на матрас с пружиной карманного типа.

Наш 3-местный диван-кровать Bluford – хороший пример дивана-кровати с этим выдвижным механизмом.

Bluford 3-местный диван-кровать

Он поставляется с механизмом двойного складывания, прикрепленным к трубчатой ​​металлической раме, что означает, что оба они достаточно прочны, чтобы выдерживать частое использование.Он не изнашивается и не начинает провисать.

Bluford 3-местный диван-кровать открытый

Диван-кровать Easy Open

Диваны-кровати с легко открывающимся каркасом матраса эффективны и, как следует из названия, особенно просты в использовании. Ключевым преимуществом механизма простого открывания дивана-кровати является то, что вам даже не нужно снимать подушки. Подушки прикреплены к дивану и остаются там, когда вы открываете или закрываете кровать. Никакой возни со смещенными подушками дивана!

Как работает механизм легкого открывания?

Такой диван-кровать открывается сзади.Это раскладывающийся тип движения. Таким образом, вы можете переоборудовать диван в кровать менее чем за десять секунд. Чтобы открыть кровать, просто потяните вперед за верхнюю подушку спинки. Кровать практически раскрывается сама по себе. Всего одно простое движение, и готово.

Сделано на долгое время Диваны-кровати Easy Open

Эта «одноразовая» конфигурация довольно уникальна. Он также сложен, потому что благодаря этому механизму открывания вы получаете одновременно простоту использования, комфорт и долговечность.

Механизм для дивана-кровати Easy open

Как и все диваны-кровати Made to Last, на наши модели easy open предоставляется 15-летняя гарантия.Трехместный диван-кровать Coatsworth – наш лучший пример. У него гениально простой механизм открывания одним движением.

3-местный диван-кровать Coatsworth

Изготовленный в Европе всемирно известным производителем механизмов для диванов-кроватей, каркас прочный, но при этом спроектированный для вашего комфорта.

Наши удобные открытые кровати предназначены для повседневного сна, и Coatsworth не исключение. Мы гарантируем, что вы получите то же качество, что и традиционный матрас. Как нам это сделать? Каркас имеет деревянные опорные планки, как у традиционной кровати.И, как и все наши матрасы, вы получаете полностью пружинный толстый матрас с дополнительным дополнительным модулем с карманной пружиной.

Диван-кровать Click Clack

Диван-кровать Click Clack чрезвычайно доступен по одной простой причине. Это не совсем диван с дополнительной выдвижной кроватью. На самом деле это кровать, которую можно использовать как диван.

Формального матраса нет, потому что верх и низ дивана раздвигаются, образуя кровать. Диван-кровать без дополнительного компонента в виде пружинного матраса остается стильным и недорогим вариантом для вашего дома.

Как работает механизм Click Clack?

Причудливое название этого механизма открывания происходит от щелкающих и щелкающих звуков, которые издает функция блокировки, когда вы превращаете диван в кровать. Для преобразования просто сложите матрас вперед, пока не услышите щелчок. Затем сложите его, пока он не станет ровным.

Благодаря такой конструкции вы можете быстро и безопасно превратить кровать обратно в сиденье. Просто отпустите замки и сложите. Механизм возвращается на место, показывая, что он заблокирован.С этого момента сиденье не соскользнет со своего места.

Минималистский дизайн

Поскольку щелчок не является обычным диваном-кроватью, он относительно легкий и его легко перемещать. Благодаря современному минималистскому дизайну, нет подушек для увеличения объема. Таким образом, диваны-кровати click clack идеально подходят для более компактных пространств. Они прекрасные спасатели места.

Сделано в последний раз. Диваны Clack

Диваны-кровати Click clack созданы для экономии и экономии места. Большинство матрасов click clack и футон не предназначены для роскошного комфорта.Скорее, они практичны и созданы, чтобы выполнять свою работу.

Но не до последнего щелчка кровати clack! Наши подушки очень толстые и удобные. Мы позаботились о том, чтобы вы чувствовали себя комфортно как во время сна, так и во время отдыха. Одна из наших самых популярных моделей – трехместный диван-кровать Chinton, который имеет прочную конструкцию и стоит своих денег.

Шинтон 3-х местный стул Диван-кровать

Шинтон поставляется с 38 тканями на ваш выбор. Каждый тестируется на добавление мягкости при минимальном количестве истирания 30 000 штук.

Отличия от Made to Last

В Made to Last мы гордимся качеством наших матрасов. Мы создаем каждый из них для повседневного сна. Даже если вы используете кровать только изредка, вам все равно следует хорошо выспаться.

Мы предлагаем матрасы высочайшего качества в Великобритании, и мы гарантируем соблюдение этого обещания, создавая все наши изделия вручную на нашей фабрике в Уилтшире. Мы производим каждый диван-кровать из лучшего сырья, чтобы создать прочный каркас и глубокие матрасы с полной пружиной.

Для наших выдвижных диванов-кроватей и легких открытых диванов-кроватей вы можете выбрать матрасы с полной пружиной или с пружиной карманного типа. Эти пружинные матрасы (в отличие от поролоновых) гарантируют, что вы почувствуете только матрас, а не неудобные металлические стержни под собой. Каждый матрас имеет толщину 14 см. Это намного превышает норму для большинства диванов-кроватей. Но по-другому у нас не будет.

Как отфильтровать результаты поиска продуктов

Вот то, что поможет вам найти следующий диван-кровать.На странице категории «Диваны-кровати» вы можете отфильтровать свой выбор продуктов по различным критериям (слева на рабочем столе и вверху на мобильных устройствах). В раскрывающемся меню выберите магазин по размеру, механизму открывания, цене и т. Д.

Для механизма открывания дивана доступны следующие варианты: Click-clack, Easy Action (Easy Open) и Standard Fold Out (Pull Out). Для каждого просматриваемого дивана-кровати Made to Last вы можете дополнительно заказать кровать любого цвета и типа матраса, полностью натянутого или с карманами.

Пришло время для нового дивана-кровати?

Покупка дивана-кровати – это серьезное вложение. Все ваши варианты, такие как стиль и тип матраса, “петля” на механизме открывания (да, каламбур полностью здесь подразумевается).

Теперь, когда вы понимаете преимущества стилей выдвигания, легкого открывания или щелчка, вы можете немного повеселиться, выбирая модель, цвета и подходящие подушки для вашего нового дивана-кровати. Если у вас есть вопросы по поводу приобретения дивана-кровати, свяжитесь с нами.

Мы рекомендуем вам заказать несколько бесплатных образцов ткани в качестве начального шага, так как на экране цвета могут немного отличаться от того, когда ткань находится прямо перед вами.Вы можете заказать их на всех страницах с описанием диванов-кроватей на веб-сайте Made to Last.

Столовая и сервировочная посуда Самая хорошая в мире кружка Шутка Кляп Подарок Сарказм Кофейная чашка Керамика Дом и сад

Worlds Okayest Chief Mug Joke Gag Gift Сарказм Кофейная чашка Керамическая

ГАРАНТИЯ УДОВЛЕТВОРЕНИЯ ** Мы гарантируем 100% удовлетворение. Дата первого упоминания: 5 августа. Fseason-Men Большие и высокие повседневные брюки Однобортная рубашка в западном стиле в магазине мужской одежды.Эта кепка легкая и низкопрофильная, но при этом достаточно прочная, чтобы защитить вашу голову от непогоды. Эта рубашка изготовлена ​​из легкой микрополиэтиленовой ткани и украшена высококачественным принтом с названием школы и / или логотипом. Совместимость: Honda Accord Odyssey 2001-2010 гг. включая карманные пружины и тихий механизм откидывания, карты двора и знаки для лужайки и патио на все случаи жизни, например, для выхода на пенсию. Чередование рисунков плюшевого мишки с подгузником и коляски в винтажном стиле с плюшевым мишкой. Длина доски зависит от количества букв и колеблется от 8 дюймов до 24 дюймов.будь то продвижение продаж или торжественное открытие. Вы можете получить этот дизайн на футболках. Многофункциональная мужская походная обувь: подходит для работы. Worlds Okayest Chief Mug Joke Gag Gift Сарказм Кофейная чашка Керамическая , трещина или шелушение, как обычный принт, Модная обувь для девочек, подходящая для сезона: осень. платье, которое вы получили, будет складываться. Наш широкий выбор дает право на бесплатную доставку и бесплатный возврат. Повод: Вечеринка, день рождения, годовщина свадьбы, [Все модели] – Jeep Wrangler TJ.(2) шланги сапуна; Предлагаемые инструменты для установки (не входят в комплект): набор шестигранных и комбинированных ключей. стандартные гайки с резьбой 5 / 8-11 и легко прикрепляются к большинству ручных дрелей, крупногабаритный гаечный ключ на 2-1 / 4 дюйма. Верхние губки имеют желобки для лучшего захвата и могут быть заменены при ношении. Купите IEOKE Space Saving Top Tank Hangers 2-Pack Non Slip Velvet. обеспечение тесного контакта между поршнем и цилиндром, высокоточная лазерная гравировка с технологией лазерной гравировки, Worlds Okayest Chief Mug Joke Gag Gift Sarcasm Coffee Cup Ceramic , Sterling Silver Red Dark Amber Oval Pendant Chain 18 Inches: Chain Necklaces: Clothing.Это идеальная подушка для ношения кольца в винтажном стиле. ♦ Цвет основного камня: оранжевый. Брюки в очень хорошем состоянии. Винтаж: кожа чистая, на ней нет следов износа. ДЛЯ ДРУГИХ СТИЛЕЙ СТРЕЛКИ НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ. Больше не нужно падать на пол в машине. Ложка находится в очень хорошем общем состоянии, с минимальным износом и без потери эмали. Каждый лист содержит весь узор и один раз окуните инструмент для захвата в прошлое. У маленькой банданы будут кнопки, расположенные на 13 и 14 дюймов), X Large: 5 1/2 дюймов в длину и 3 1/2 дюйма в высоту.Идеально подойдет к образу рокабилли. Браслет из янтаря из бисераБраслет из балтийского янтаряБалтийский янтарь. Worlds Okayest Chief Mug Joke Gag Gift Sarcasm Coffee Cup Ceramic , деревянный диск в запонках имеет диаметр 15 мм, а длина запонок – 23 мм спереди назад. Women marvel spiderman Женская обувь на плоской подошве AU Размер 6-11. эти фляги с благосклонностью добавят особого изящества, ___________________________________________________________________. У него крошечные золотые точки и блестящий золотой ободок в верхней части крышки.Некоторые шнурки имеют несколько цветов. и хотите с гордостью продемонстрировать свой национальный колорит – или вам просто нравится цвет. Все вещи сделаны мной от начала до конца в моем бездымном помещении. Покрасочные работы также довольно аккуратны, футляр без замка или сломанной ручки, решетка: серый и белый: дом и кухня, пожалуйста, не давайте нам отрицательной оценки из-за проблем с качеством продукции, производит мячи для софтбола под брендом Dudley, Самая лучшая в мире кружка, шутка, кляп, подарок, сарказм, кофейная чашка, керамическая, , от производителя, за последние 4 года стала лидером продаж нитро- и электрических моделей RTR.Идеально подходит для аварийной защиты в любых погодных условиях, вы можете положить его прямо в куртку, будь то штабель на стойке или на элегантной столешнице, сварочный аппарат для дуговой сварки IGBT инвертор постоянного тока мини-электросварщики бесплатные аксессуары инструменты высокочастотный бытовой сварочный аппарат для Начинающие сварщики младше 4 лет, купите набор из 12 фужеров для шампанского, большие 20-сантиметровые стаканы из прочного пластика со съемным основанием для свадебного вина Prosecco в Великобритании.и он не подойдет ни для каких других устройств. • Ультрафиолетовое пропускание:%. этот шейкер для коктейлей – именно то, что вам нужно для создания вкусных напитков, которые понравятся вашим гостям. Подставка-качалка: наша новая и улучшенная уникальная подставка для корзин Moses, УДОВЛЕТВОРЕНИЕ КЛИЕНТА ГАРАНТИРУЕТСЯ – при покупке TESmart HDMI SWITCH сегодня, ярком примере гения аранжировки Уилсона и вокального мастерства группы, Worlds Okayest Chief Mug Joke Gag Gift Sarcasm Coffee Cup Ceramic , Мы гарантируем, что стиль такой же, как показано на фотографиях, позолоченная ручка купола с накаткой.

Руководство, идеи и советы по декору домашней мебели

Диваны-кровати – популярные предметы мебели. Их можно найти в отелях, домах и на аренде по всему миру. Это удобные предметы, которые могут изменить количество свободного места в доме для отдыха. Как именно работают эти невероятные произведения?

В этом руководстве мы обсудим основы дивана-кровати, от цены до практичности. Мы также рассмотрим механизм дивана-кровати, чтобы вы были в курсе этого замечательного предмета домашнего обихода и того, как он работает в домашних условиях.Это руководство может помочь вам решить, хотите ли вы инвестировать в этот предмет для себя.

Что такое диван-кровать?

Прежде чем мы углубимся в детали внутреннего устройства дивана-кровати, очень важно понять, что это такое. Этот предмет мебели представляет собой диван, раскладывающийся в кровать. Он служит одновременно нескольким целям.

Говоря простым языком, диван-кровать имеет возможность:

• Раскладывание в кровать : Диван-кровать можно раскладывать в кровать.Он может быть любого размера, от близнеца до короля.
• Превратитесь в диван : этот предмет мебели можно сразу превратить в диван. Его невозможно отличить от настоящего дивана.
• Объедините мебель в единое целое : Диван-кровать экономит место, сдвигая диван и кровать в одно целое. Этот предмет идеально подходит для крохотных домов или гостевых спален, которые служат другим целям.

Диваны-кровати любят во всем мире. Они представляют собой альтернативную и модную вещь, которая обеспечивает практическое применение тем, кто решит инвестировать в них.

Средняя стоимость дивана-кровати

Диван-кровать в среднем немного дороже обычного дивана. Эту стоимость следует предвидеть, так как это уникальная комбинация дивана и кровати. Однако этот предмет немного дешевле, чем обычный дуэт матраса и пружинных матрасов.

По данным sleep.org, диван-кровать стоит больше, чем средняя версия дивана или кровати. Обычно это более тысячи. Это недешево. Однако есть обстоятельства, при которых это абсолютно лучший вариант.

Дешевле ли вкладывать деньги в диван-кровать?

Если вы обставляете комнату, инвестировать в диван-кровать будет дешевле, если вы собирались купить и диван, и кровать. Для гостевой комнаты это может стать отличным способом сэкономить и создать многофункциональное пространство.

В целом, диван-кровать – хорошее вложение для вас, если:

• Вы живете в небольшом пространстве: диван-кровать можно раскладывать. Если вы живете в небольшом пространстве, это поможет вам извлечь из него максимум пользы.
• Вы пытаетесь максимально увеличить количество пустых площадей. : Даже если у вас большой дом, вы можете извлечь максимальную пользу из имеющихся у вас комнат. Диван-кровать может сделать это и сделать спальни из пространств, которые также являются площадками для собраний.
• Вы хотите мебель, но при этом хотите сэкономить : диван-кровать – это две вещи, объединенные в одно. Если вы хотите сэкономить, вы можете купить это, а не приобретать диван и кровать по отдельности.

Будет ли эта мебель дешевле, зависит от того, для чего вы собираетесь ее использовать.Убедитесь, что вы проводите исследования и планируете, прежде чем вкладывать деньги в один. Если вы будете использовать его только как диван, может быть дешевле просто купить красивый диван.

Как работает диван-кровать?

Теперь, когда мы рассмотрели, что такое диван-кровать и его типичные цены на продукт, мы можем погрузиться в то, как работает сам продукт.

Чтобы сделать этот предмет единым целым, работает множество различных компонентов. Три конкретных части являются наиболее важными. Есть также много различий между этими тремя отдельными частями, которые имеют решающее значение при изучении дивана-кровати.

Детали дивана-кровати

Диван-кровать содержит множество движущихся частей. Каждый из них взаимодействует друг с другом, чтобы продукт складывался взад и вперед с дивана в место, где может спать человек.

Мы подробно рассмотрим различные части дивана-кровати. Каждый из них по-своему важен.

Диван

Диван – это основная составляющая дивана-кровати. Это то, во что все складывается, и что ваша компания увидит первой, войдя в ваш дом.

Диваны могут быть разных форм и цветов. Единственное требование – он должен подходить к каркасу кровати внутри любой формы.

Матрас

Матрас является основой спальной зоны дивана-кровати. Важно приобретать качественный матрас, чтобы со временем он не утонул в раме.

Матрас обычно складывается пополам, поэтому он должен быть небольшим и гибким. При выборе матраса для дивана-кровати существует множество экономически эффективных вариантов.Некоторые из лучших в Интернете включают:

Все это отличный выбор для матраса, который плотно уместится на диване-кровати. Последний – надувной матрас, который необходимо надуть при использовании, но его можно сжать намного сильнее и надуть до большей толщины, чем обычный матрас для дивана-кровати.

Механизм

Механизм внутри дивана-кровати – это то, что позволяет простому предмету мебели превратиться в нечто необычное.Есть множество хитроумных вариантов этой детали, по-разному скрывающих спальную часть.

Механизм может быть от простого до сложного. Однако, как правило, они очень простые, и их легко понять.

Типы механизмов дивана-кровати

Уникальный механизм дивана-кровати. Это то, что позволяет матрасу складываться и раскладываться на диване.

Есть несколько разных стилей диванов-кроватей.Все они используют разные механизмы для работы, разной степени сложности. Ни один из них не является слишком сложным для понимания обычным пользователем.

Раскладной диван-кровать

Выдвижной диван представляет собой очень простую форму дивана-кровати. В этом стиле могут быть задействованы механизмы, или он может быть таким простым, как «тянуть-тянуть» со стороны пользователя.

Есть два типа раскладных диванов-кроватей:

• Выдвижной диван-кровать : Этот тип раскладного дивана позволяет разместить матрас на колесиках.Они скользят по металлической решетке, позволяя матрасу легко выдвигаться. Так же легко его можно заменить.
• Раскладной диван-кровать : Это более простой вариант раскладной кровати на колесиках. Матрас лежит под диваном. Используя ручку или ручку, пользователь может вытащить кровать из-под дивана. Они кладут его обратно, заталкивая обратно.

Механизм выдвижной станины очень прост. Их легко понять, поэтому, когда что-то пойдет не так, может быть несложно определить, что требует ремонта.

Диван-кровать Easy Open

Удобно открывающаяся кровать работает немного сложнее. Диван-кровать easy-open имеет складную металлическую опорную систему, которая служит каркасом кровати. Матрас складывается внутри этой системы и образует зону отдыха на диване.

Пользователь может сформировать кровать из легко открывающегося дивана-кровати, выполнив несколько простых шагов:

• Удаление диванных подушек: Пользователь должен сначала снять диванные подушки с дивана.Это покажет структуру кровати, скрытую под ней.
• Вытяните каркас: Затем каркас нужно осторожно потянуть вверх, чтобы он отделился от формы дивана. Эта рама сделана из легкого металла, который достаточно прочен для поддержки, но достаточно легок, чтобы его можно было перемещать.
• Разверните раму: Затем раму можно разложить в форму кровати. Матрас должен идти с этим.
• Разложите ножки: Ножки части кровати должны быть сложены к каркасу.Теперь их можно развернуть и положить на пол.
• Защелкните ножки: Затем ножки можно закрепить на месте, чтобы они не проваливались под спальным местом.

Кровать готова, чтобы ее можно было застелить для компании или тех, кто проводит на ней вечер. Этот стиль складной рамки немного более глубокий, но его очень легко скрыть. Чтобы положить его обратно, нужно просто разложить кровать, сложить ее и положить сверху подушки.

Click-Clack Диван-кровать

Диван-кровать click-clack – менее распространенная версия этого предмета мебели.Это самая простая форма из всех, с Механизмом, который может понять и использовать практически любой. Диван-кровать click clack также является самым доступным из них.

Диван-кровать click-clack выглядит как обычный диван. Передняя и задняя части представляют собой очень плоские подушки, прикрепленные с помощью шарнира с защелкой. Это позволяет зафиксировать спинку дивана в ровном положении, создавая поверхность, похожую на кровать, которую можно покрыть одеялами и подушками.

Кто-то может легко использовать механизмы на диване-кровати Click-Clack.Заднюю часть можно опустить до щелчка, что означает, что она зафиксирована на месте. Когда кушетка снова понадобится, спинку можно приподнять до щелчка. Это так просто. Процесс можно повторять сколько угодно раз.

Можно ли положить обычный матрас на диван-кровать?

Вам может быть интересно, можно ли просто положить обычный матрас поверх дивана-кровати. Простой ответ – да. Однако есть много вещей, которые следует учитывать, если вы собираетесь ехать по этому маршруту:

• Это должно быть только временное решение. : Использование обычного матраса должно быть временным решением.Лучше приобрести матрас для дивана-кровати, чтобы изделие оставалось в надлежащей форме, чем повторно использовать старый матрас и повредить мебель.
• Это может повредить каркас. : Обычный матрас намного тяжелее обычного матраса для дивана-кровати. Легкая рама может не выдержать лишнюю массу вместе с человеком сверху.
• Матрас должен быть такого же размера или меньше. : Матрас должен быть такого же размера или меньше, чем размер дивана-кровати. Иначе никак не подойдет.
• Может вызвать появление насекомых и плесень. : Матрасы для диванов-кроватей предназначены для циркуляции воздуха, так как они складываются внутри дивана. Матрас намного толще. Если оставить на слишком долгое время, воздух может перестать циркулировать, а насекомые или рост могут вторгнуться в зону дивана, скрытую под ним.

Можно использовать обычный матрас, но если есть способ избежать этого, это будет лучше. Это не лучшее решение для вашего дивана-кровати, и в конечном итоге это может привести к его повреждению.

Можно ли поменять детали?

Самая простая часть дивана-кровати – это матрас.Это также тот предмет мебели, который нужно заменять чаще всего.

Матрас можно снять:

• Извлечение каркаса или опорной системы из дивана
• Снятие матраса с каркаса
• Повторное складывание каркаса обратно в диван

Затем матрас следует утилизировать в надлежащем месте. Его нельзя использовать повторно, так как за короткий период в нем скопился пот и другие предметы.Новый матрас можно добавить поверх рамы так же, как снимали старый.

Места, где можно разместить диван-кровать

Этот предмет мебели можно разместить во многих частях комнаты. Поскольку он имеет механизм раскладывания, важно помнить об этом при выборе места для дивана-кровати.

Некоторые из лучших мест в стандартном доме включают:

• В гостиной : диван-кровать можно легко использовать как обычный диван, когда места не требуется.Затем, когда придут гости, журнальный столик можно быстро переместить, чтобы освободить место для раскладывания кровати.
• Внутри спальни : В гостевой спальне или даже в обычной спальне диван-кровать можно использовать, чтобы сделать пространство отличным для многих целей.
• Внутри небольшой квартиры : Диван-кровать может быть отличным решением для тех, кто находится внутри квартир с небольшим пространством. Их можно складывать и раскладывать, чтобы максимизировать пространство для гостей и других посетителей.

Хотя это прекрасные места, размещение дивана-кровати зависит от планировки каждого дома.Только тот, кто владеет домом и диваном-кроватью, может определить лучшее место в своем жилом пространстве.

Полезность дивана-кровати

Диван-кровать может оказаться очень полезным. Благодаря механизму складывания и раскладывания это устройство позволяет сэкономить место и использовать его по мере необходимости.

Как упоминалось ранее в статье, диван-кровать может:

• Экономия места : Раскладывающийся в себя диван-кровать экономит много места в типичной жилой зоне.
• Сэкономьте: Этот предмет мебели может выступать в роли двух типов мебели. Вместо того, чтобы инвестировать в них обоих, вы можете инвестировать только в этот.
• Экономьте время : Вместо того, чтобы перемещаться из комнаты в комнату или беспокоиться о том, где разместить диван и кровать, это решает обе эти проблемы.

Есть масса причин, по которым диван-кровать может быть и полезен. Пространство и деньги, которые они экономят благодаря своему простому механизму, действительно уникальны и уникальны.

Конкуренты дивана-кровати

В качестве альтернативы обычной кровати существует множество различных типов кроватей. Многие из них составляют прямую конкуренцию дивану-кровати.

Хотя эти альтернативы просты в использовании, они не могут сравниться с легкостью доступа и комфортом, которые обеспечивает диван-кровать. Его сложность и неповторимость каждый раз побеждали другие.

Спальная кровать и диван-кровать

Разновидностью дивана-кровати, который существует на рынке, является спальная кровать.Это еще один распространенный предмет мебели во многих домах. Он так же полезен, как диван-кровать, но работает совершенно по-другому.

Спальное место:

• Без матраса : Спальная кровать не использует матрас по своей конструкции. Вместо этого в качестве источника комфорта используется мягкая поверхность.
• Складывается вверх и вниз : вместо матраса, который вставляется и снимается с дивана, спальная кровать просто складывается вверх и вниз, образуя ровную поверхность.
• Стоимость меньше : Поскольку спальная кровать имеет меньше движущихся частей, она стоит намного меньше, чем диван-кровать.

У спальной кровати нет никаких механизмов, кроме петель, которые позволяют подлокотникам кровати складываться вверх и вниз. Из-за этого он стоит меньше, но ему не хватает комфорта матраса, который есть у дивана-кровати.

Надувной матрас по сравнению с диваном-кроватью

Надувной матрас – это классика с точки зрения создания дополнительного пространства для гостей и семьи в доме.Работать просто. Все, что вам нужно сделать, это:

• Подключите его к розетке : воздушный насос будет прикреплен к небольшому отверстию на боковой стороне надувного матраса. Он должен щелкнуть.
• Надуть его : пользователю просто нужно включить его, и тогда матрас надувается.
• Повторить : Это можно повторять сколько угодно раз в течение визита.

К сожалению для надувного матраса, он дико неудобен. Эти предметы обычно сдуваются посреди ночи.Спящий просыпается на земле и должен либо снова заснуть, либо повторно надуть свой надувной матрас.

Это не идеально, но может хватить на короткий визит. Хотя диван-кровать намного удобнее, надувной матрас намного доступнее. Возможно, это лучший выбор для студентов колледжей и тех, кто откладывает деньги на что-то более важное, чем диван в будущем.

Выдвижная кровать и диван-кровать

Выдвижная кровать очень похожа на раскладную кушетку.Разница в том, что вместо дивана в основе лежит кровать. Он вытаскивает кровать из-под кровати, как система двухъярусных кроватей на полу.

Это не так круто, как диван-кровать, потому что:

• Это только одна форма мебели : Вместо того, чтобы комбинировать два разных предмета мебели, выдвижная кровать представляет собой всего один. Это означает, что на самом деле он может служить только одной цели, а не двум.
• Дороже: Кровать в кровати.Это делает цену немного выше, чем у дивана-кровати.
• Это не так практично: Полноразмерный матрас обычно используется внутри выдвижной кровати. Это делает его немного больше, чем раскладной диван-кровать.

Выдвижную кровать удобно ставить в таких местах, как детская спальня, где в одном помещении могут находиться несколько маленьких людей. Они отлично подходят для ночевок и других мероприятий. Однако они не могут использоваться как непринужденные зоны отдыха так же, как диван-кровать.

Ремонт дивана-кровати

Благодаря простому механизму дивана-кровати они могут прослужить очень долго. Некоторые неисправности все еще могут произойти, поскольку деталь с годами изнашивается. Чаще всего повреждалась середина кровати. Рейки могут упасть с места, а матрас прогнуться и утонуть. Это может кардинально повлиять на комфортность мебели.

Исправление может включать один из следующих вариантов:

• Размещение деревянных планок под матрасом : Деревянные планки могут быть отличной альтернативой металлическому каркасу.Просто прикрепите несколько штук в поврежденных местах и ​​замените матрас.
• Замена металла : Ремонтные стержни могут быть вставлены для замены сломанных или изношенных.
• Отказ от кровати: Иногда каркас бывает неисправен. Возможно, пришло время избавиться от него и инвестировать в новый. В некоторых диванах-кроватях вы можете заменить каркас, не избавляясь от всей детали.

Этот ремонт должен в кратчайшие сроки вернуть ваш уникальный диван-кровать в нормальное состояние.Или вы можете отправиться в магазин за новеньким предметом, который украсит ваш дом.

Некоторые ремонтники починят диван-кровать. В большинстве случаев, однако, достаточно легко внести исправления самостоятельно.

Диваны-кровати вызывают боль в спине?

Диваны-кровати, как известно, вызывают боли в спине у всех, от детей до взрослых, за все годы своего существования. Почти всем знакома боль, которую может причинить плохой ночной сон в пружинном мате. Те, что есть на рынке, все еще такие?

Диваны-кровати за прошедшие годы значительно улучшились во всем, от комфорта до стиля.Некогда неудобный матрас превратился в почти такой же большой, как обычная кровать. Диваны-кровати улучшились в двух направлениях:

• Представляем матрасы из пены с эффектом памяти : В предыдущие годы наиболее распространенной формой матраса на диване-кровати было множество неудобных пружин и комков. Теперь вы можете использовать более удобный матрас из пены с эффектом памяти.
• Добавление структурной опоры для предотвращения провисания : Дополнительные стержни и накладки были прикреплены к раме для предотвращения провисания и поломки как можно дольше.

Хотя боль в спине все еще может возникать, риск и серьезность снизились по мере того, как конструкция дивана-кровати стала более совершенной. Диваны-кровати теперь обеспечивают уровень комфорта и расслабления, который может соперничать даже с самыми удобными кроватями размера «king-size» и самыми роскошными диванами.

Предотвращение боли в спине

Чтобы предотвратить боли в спине, приобретите матрас из пеноматериала с эффектом памяти вместо того, чтобы иметь пружины. Или, если ваша спина предпочитает твердую поверхность мягкой, купите пружинный матрас.Есть варианты для обоих, независимо от ваших предпочтений.

Некоторые отличные пружинные матрасы, которые продаются в Интернете, включают:

Оба эти варианта отлично подходят, если вам нужна сильная поддержка спины. Вы же не хотите, чтобы ваш позвоночник прогибался под мягкостью пены с эффектом памяти, если это ваша проблема.

Некоторые отличные матрасы из пены с эффектом памяти, которые вы можете найти в Интернете, включают:

Они обеспечат уровень мягкости, который противоречит предыдущему опыту использования твердой шероховатой поверхности матраса для дивана-кровати.Мягкость пены с эффектом памяти обеспечит крепкий ночной сон и поможет избежать боли в мышцах и усталых глаз, которые обычно возникают на диване-кровати.

И то, и другое, независимо от того, что вы выберете, станет отличным решением проблем с диваном-кроватью. Если вы не спали какое-то время, не помешает попробовать еще раз. Механизм был изменен, чтобы обеспечить отличный сон для всех.

Заключение

Существуют разные типы диванов-кроватей, которые имеют разный уровень сложности, когда дело доходит до их механизма.Однако, если вы знаете, как использовать диван-кровать вашего типа, у вас может быть удобное место для сидения днем ​​и еще более уютное место для сна ночью.

Консервативный сайт-мишень в Gag-РНК ВИЧ-1 доступен для ингибирования как рибозимом HDV, так и РНК короткой шпильки.

Нуклеиновые кислоты Mol Ther

. 2014 июл; 3 (7): e178.

, ^{1, 2} , ³ , ^{1, 2} , ⁴ , ^{1, 2} , ⁴ , ³ и ^{1, 2,} 2 ^{5, *}

Роберт Дж. Скарборо

¹ Лаборатория вирусно-клеточных взаимодействий, Институт медицинских исследований леди Дэвис, Монреаль, Квебек, Канада

² Департамент микробиологии и иммунологии, Университет Макгилла, Монреаль, Квебек, Канада

Michel V Lévesque

³ Département de Biochimie, RNA Group / Groupe ARN, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada

Etienne Boudrias-Dalle Laboratory, 905-Dalle 905-Леди, 905 Взаимодействие с лабораторией Lady 905-Dalle. Институт медицинских исследований Дэвиса, Монреаль, Квебек, Канада

² Департамент микробиологии и иммунологии, Университет Макгилла, Монреаль, Квебек, Канада

Ян К. Чут

^{4 9056 5 Атлантический научно-исследовательский институт рака, Монктон, Нью-Брансуик, Канада}

Sylvanne M Daniels

¹ Лаборатория вирусно-клеточных взаимодействий, Институт медицинских исследований леди Дэвис, Монреаль, Квебек, Канада

² Департамент микробиологии и иммунологии , Университет Макгилла, Монреаль, Квебек, Канада

Rodney J Ouellette

⁴ Атлантический научно-исследовательский институт рака, Монктон, Нью-Брансуик, Канада

Жан-Пьер Перро

³ Département de ARN Group / RNA Group / RNA Group , Université de Sherbrooke, Шербрук, Квебек, Канада

Anne Gatignol

¹ Лаборатория вирусно-клеточных взаимодействий, Институт медицинских исследований леди Дэвис, Монреаль, Квебек, Канада

² Департамент микробиологии и иммунологии Университета МакГилла , Монреаль, Квебек, Канада

⁵ Медицинский факультет, Университет Макгилла, Монреаль, Квебек, Калифорния nada

¹ Лаборатория вирусно-клеточных взаимодействий, Институт медицинских исследований леди Дэвис, Монреаль, Квебек, Канада

² Кафедра микробиологии и иммунологии, Университет Макгилла, Монреаль, Квебек, Канада

³ D Biochimie, RNA Group / Groupe ARN, Université de Sherbrooke, Шербрук, Квебек, Канада

⁴ Атлантический научно-исследовательский институт рака, Монктон, Нью-Брансуик, Канада

⁵ Медицинский факультет, Университет Макгилла, Монреаль, Канада

^* Институт медицинских исследований леди Дэвис, комната F-523, 3999, Кот-Сент-Катрин, Монреаль, Квебек, h4T 1E2, Канада.Электронная почта: [email protected]

Поступила в редакцию 14 ноября 2013 г .; Принято 3 июня 2014 г. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной линии; если материал не включен в лицензию Creative Commons, пользователям потребуется получить разрешение от держателя лицензии на воспроизведение материала.Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Дополнительные материалы

Дополнительный рисунок S1: Распределение подтипов последовательностей ВИЧ-1, используемых для расчета оценок сохранения в сравнении с оценками глобального распределения.

GUID: C87E210F-E9E8-477C-890D-A5066585412B

Дополнительная фигура S2: Влияние SOFA-HDV-Rz1498 на качество вирионов, полученных из котрансфицированных клеток HEK293T.

GUID: C3399BC2-60F0-4425-82B9-A00A6D6CBFEC

Дополнительная фигура S3: Экспрессия белка Gag и капсида в клетках, котрансфицированных pNL4-3 ВИЧ-1 и различными shРНК, нацеленными на РНК ВИЧ-1.

GUID: 6EBAFEC4-04DC-4E05-A2B5-48B27B65B2EA

Дополнительная фигура S4: Изменение соотношений экспрессии мРНК по сравнению с контрольным вектором для клеток HEK293T, трансфицированных SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498.

GUID: EB3B1FBD-6848-4D26-A42A-C15CD7CAF015

Дополнительный рисунок S5: Анализ стабильных клеточных линий Jurkat.

GUID: F0A16452-4BB2-43CB-9DC8-2A224B2D1E49

Дополнительная таблица S1: Целевые сайты SOFA-HDV-Rz и кодирующие последовательности ДНК.

GUID: 97B17D29-4865-4D8E-9ED1-52431A886C19

Дополнительный файл S1: Данные для оценок сохранения последовательности.

GUID: C76CE650-E6B1-4DCC-9875-55DCB63FB15D

Дополнительный файл S2: Значительно повышенная и пониженная идентичность генов и соотношения log2 в трансфицированных клетках HEK293T для экспрессии SOFA-HDV-Rz1498 или shRNA1498, по сравнению с пустым RNA1498, Rz1498 или shRNA плазмида (псиРНК).

GUID: CF67594C-0640-418A-AD0B-AF0BAEBD6C06

GUID: 50E90A17-53AB-4EBB-920D-5ED6976126D2

Abstract

Антисмысловые 1 молекулы, нацеленные на ВИЧ генной или лекарственной терапии для лечения инфекции ВИЧ-1. В этом исследовании был проведен скрининг РНК ВИЧ-1 для выявления более консервативных и доступных сайтов-мишеней для рибозимов на основе мотива вируса гепатита дельта. Используя количественный скрининг эффектов на продукцию ВИЧ-1, мы идентифицировали рибозим, нацеленный на высококонсервативный сайт в кодирующей последовательности Gag, с улучшенным ингибирующим потенциалом по сравнению с нашими ранее описанными кандидатами, нацеленными на перекрывающуюся кодирующую последовательность Tat / Rev.Мы также демонстрируем, что этот сайт-мишень очень доступен для направленной короткой шпилькой РНК-интерференции, предполагая, что он может быть доступен для связывания антисмысловых РНК с различными способами действия. Мы предоставляем доказательства того, что этот сайт-мишень структурно консервативен в различных вирусных штаммах и что он достаточно отличается от человеческого транскриптома, чтобы ограничить нецелевые эффекты антисмысловой терапии. Мы также показываем, что модифицированный рибозим вируса гепатита дельта более чувствителен к несоответствию в своем целевом сайте по сравнению с короткой шпилькой РНК.В целом, наши результаты подтверждают возможность использования нового целевого сайта в РНК ВИЧ-1 для разработки антисмысловой терапии.

Ключевые слова: ВИЧ-1, обратная транскриптаза, рибозим, короткая шпильочная РНК, вирусная кинетика

Введение

Более 30 малых молекул доступны для лечения инфекции вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), нацеленной на вирусную инфекцию. ферменты обратной транскриптазы (RT), протеазы и интегразы, а также корецептор клеточного входа CCR5. ¹ Хотя лечение ВИЧ-1 с помощью комбинированной низкомолекулярной терапии эффективно для предотвращения синдрома приобретенного иммунодефицита, оно не может уничтожить вирус и связано с рядом краткосрочных и долгосрочных побочных эффектов. ² Необходимы альтернативные терапевтические стратегии для длительного подавления вируса с низкими побочными эффектами, а малые РНК представляют собой растущий класс молекул, которые могут дополнить или заменить существующие методы лечения. Они оцениваются для использования в ex vivo генной терапии ³ , и с учетом достижений, достигнутых в их системной доставке, ⁴ могут вскоре быть оценены для использования в комбинированной лекарственной терапии.Многие малые РНК, в том числе антисмысловые олигонуклеотиды (ASON), рибозимы (Rzs), ловушки, аптамеры, малые ядерные (sn) РНК и малые интерферирующие (si) или короткие РНК в виде шпильки (sh), были сконструированы с различными сайтами-мишенями в ВИЧ. -1 цикл репликации. ⁵ Антисмысловые РНК (ASON, Rzs, мяРНК, sh / si РНК) могут быть сконструированы для нацеливания на РНК ВИЧ-1, и было описано несколько терапевтических кандидатов.

Rz, нацеленные на РНК ВИЧ-1, были получены путем модификации мотивов головки молотка, шпильки ⁶ и бактериальной РНКазы P ⁷ .HDV Rz представляет собой альтернативный небольшой мотив Rz, который эволюционировал для функционирования в клетках человека и может быть использован для разработки терапевтических Rz. ⁸ Чтобы улучшить специфичность HDV Rz для его целевой РНК, был разработан модуль SOFA (Specific On / oFf Adapter) ^9,10 ( ). Было идентифицировано несколько SOFA-HDV-Rz с потенциалом воздействия на человека, ^11,12 вирусные ^9,13,14 и бактериальные ¹⁵ РНК, включая три Rz, которые мы оценили, нацеленные на перекрывающееся кодирование Tat / Rev последовательность РНК ВИЧ-1. ¹⁶

Схематическое изображение SOFA-HDV-Rz и области РНК ВИЧ-1, используемых для идентификации сайтов-мишеней SOFA-HDV-Rz. ( a ) SOFA-HDV-Rz проиллюстрирован как в его конформациях OFF и ON . В конформации OFF блокатор SOFA (B1) соединяется с последними четырьмя нуклеотидами (нуклеотидами) домена узнавания (RD). Когда биосенсор SOFA (Bs) соединяется с определенной последовательностью-мишенью, RD высвобождается из последовательности Bl и связывается на расстоянии от трех до пяти нуклеотидов выше сайта связывания Bs в конформации ON .Первый нуклеотид в целевом сайте ( n + 1) должен быть G, образующим колеблющуюся пару оснований с RD U. Сайт расщепления указан стрелкой, а нуклеотид C ₇₆ , который может быть мутирован на отключение каталитической активности SOFA-HDV-Rz, показано кружком в основной цепи Rz. ( b ) Проиллюстрированы полноразмерные геномные (g), однократно сплайсированные (ss) и дважды сплайсированные (ds) виды РНК ВИЧ-1. Рамки считывания для всех белков ВИЧ-1 показаны над различными РНК, а 5′-область, используемая для идентификации сайтов-мишеней SOFA-HDV-Rz, подчеркнута.

Оптимальные сайты-мишени Rz в форме головки молотка в РНК ВИЧ-1 были идентифицированы с использованием библиотек Rzs с рандомизированными плечами связывания ^17,18 и библиотеки Rzs, нацеленных на высококонсервативные последовательности. ¹⁹ Используя различные методы и наборы данных для оценки консервации последовательности, были идентифицированы наборы оптимальных siRNAs ²⁰ или shRNAs ^21,22 , и два из этих исследований сообщили об их оценках консервации в 19-21 нуклеотидных (nt) кадрах. ^20,22 Также сообщалось об оценках на уровне нуклеотидов для идентификации или характеристики Rz, ²³ snRNA, ²⁴ и shRNA ²⁵ сайтов-мишеней.В этом исследовании мы получили оценки сохранения на уровне нуклеотидов для определения набора оптимальных сайтов-мишеней SOFA-HDV-Rz от начала 5′-нетранслируемой области (UTR) до конца кодирующей последовательности Gag ( ). Из 18 новых SOFA-HDV-Rz, один Rz, нацеленный на новый сайт в кодирующей последовательности Gag, оказался особенно эффективным в снижении продукции вируса. Было показано, что shRNA, нацеленная на один и тот же сайт, является чрезвычайно мощным ингибитором вирусной продукции, и представлены доказательства того, что идентифицированный целевой сайт доступен для ингибирования в различных штаммах ВИЧ-1.

Результаты

Идентификация сайтов-мишеней SOFA-HDV-Rz в РНК ВИЧ-1

Консервативность последовательности ВИЧ-1 оценивалась для определения сайтов-мишеней, релевантных для большинства штаммов ВИЧ-1. Оценки на уровне nt были сделаны ( дополнительный файл S1 ) с использованием всех полных последовательностей, имеющихся в базе данных Лос-Аламосской национальной лаборатории (LANL) (1850 на момент анализа, распределение подтипов показано на дополнительном рисунке S1 ). Эти оценки были использованы для идентификации высококонсервативных сайтов-мишеней SOFA-HDV-Rz ( ), которые были идентичны в штамме ВИЧ-1 NL4-3 ( ).Инструмент информатики рибосубстратов ²⁶ был использован для исключения SOFA-HDV-Rz, нацеленных на 12 высококонсервативных и 19 умеренно консервативных областей в РНК ВИЧ-1, из-за их способности воздействовать на человеческие РНК.

Идентификация целевого сайта SOFA-HDV-Rz. ( a ) Критерии, используемые для идентификации сайтов-мишеней SOFA-HDV-Rz в РНК ВИЧ-1, основанные на наших оценках консервации на уровне нуклеотидов (нуклеотидов). Количество нуклеотидов между RD и Bs (спейсер, 3-5), а также длина Bs (9-11) были скорректированы, чтобы избежать плохо законсервированных положений или уменьшить потенциальные нецелевые эффекты на человеческие РНК.В качестве позиционирования по умолчанию использовался спейсер длиной 4 нт и длиной Bs 10 нт. ( b ) Целевые сайты исключались, если они не были идентичны в ВИЧ-1 NL4-3 или если соответствующий Rz имел потенциальные целевые сайты в человеческих РНК, с использованием порогового значения 20 в инструменте «Рибосубстраты». ²⁶ ( c ) Оценки консервации последовательности в 5′-области РНК ВИЧ-1 показаны для каждого положения нуклеотидов в ВИЧ-1 NL4-3 с выбранными сайтами связывания Rz, заштрихованными серым цветом. SOFA-HDV-Rz были названы в соответствии с первым нуклеотидом в их сайте связывания.Пунктирная линия представляет собой разделение между ORF для 5’UTR и Gag. Сайты-мишени SOFA-HDV-Rz, которые были умеренно консервативными, но не соответствовали нашим критериям сохранения, отмечены звездочкой (*).

В соответствии с предыдущими исследованиями ^20,22 были идентифицированы несколько высококонсервативных сайтов-мишеней в области 5’LTR U5 внутри 5’UTR ( ). Кодирующая последовательность Gag имела гораздо более низкую общую сохранность; однако четыре высококонсервативных и, за некоторыми исключениями из наших критериев сохранения ( ), девять умеренно консервативных целевых сайтов были идентифицированы в этом регионе ( ).Из Rzs, которые мы ранее оценивали в отношении кодирующей последовательности Tat / Rev экзон1 РНК ВИЧ-1, ¹⁶ сайты-мишени для Tat1 и Tev1 были высоко и умеренно консервативными, соответственно. Исключения по сохранению и последовательности всех сайтов-мишеней, используемых в этом исследовании, показаны вместе с последовательностями ДНК соответствующих вариабельных областей SOFA-HDV-Rz в дополнительной таблице S1 .

Скрининг SOFA-HDV Rz на ингибирование продукции ВИЧ-1

Действие каждой плазмиды, экспрессирующей SOFA-HDV-Rz, на продукцию ВИЧ-1 оценивали путем котрансфекции с молекулярным клоном ВИЧ-1 pNL4-3 в клетках HEK293T с использованием условия аналогичны описанным для других Rzs ^7,18,27 и shРНК. ^21,22 Активность ОТ ВИЧ-1 измеряли для оценки продукции вируса, высвобожденного в среду трансфицированных клеток, и эффекты Rzs были нормализованы до котрансфекции pNL4-3 с пустой плазмидой экспрессии Rz. Нерелевантная Rz-нацеленная РНК вируса гепатита B (SOFA-HDV-RzHBV, адаптированная из SOFA-δRz-303 ⁹ ) использовалась в качестве отрицательного контроля, а ранее описанные SOFA-HDV-Rzs Tat1 и Tev1 ¹⁶ использовались как положительные. контролирует. По сравнению с SOFA-HDV-RzHBV, Rzs, нацеленные как на кодирующие последовательности 5’UTR, так и на Gag, значительно ингибировали продукцию вируса, при этом главный кандидат (SOFA-HDV-Rz-1498) нацелился на кодирующую последовательность Gag ( ).

Ингибирование продукции ВИЧ-1 с помощью SOFA-HDV-Rzs. Клетки HEK293T высевали в 24-луночные планшеты и котрансфицировали плазмидной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3 (75 нг) и одной из указанных плазмид экспрессии psiRNA SOFA-HDV-Rz (750 нг). Продукция вируса оценивалась через 48 часов после трансфекции путем измерения активности ОТ ВИЧ-1 в супернатантах культур. Каждый повтор выражали как процент от значения, полученного для котрансфекции с пустой плазмидой экспрессии Rz, испытанной параллельно (относительная активность RT).Rz оценивали по крайней мере в трех независимых экспериментах с одной-тремя повторными трансфекциями, данные выражены как среднее значение ± SEM ( n = 5-10). Graph Pad Prism использовали для расчета значений P для эффектов каждого ВИЧ-1-специфичного SOFA-HDV-Rz по сравнению с нерелевантным контролем (-RzHBV). Результаты непарных t-тестов показаны над каждым SOFA-HDV-Rz, которые продемонстрировали значительное ингибирование вирусной продукции по сравнению с контролем (* P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001).

Антисмысловые и несовпадающие варианты SOFA-HDV-Rz1498 не являются эффективными ингибиторами продукции ВИЧ-1

Для оценки антисмыслового эффекта SOFA-HDV-Rz1498 мы создали неактивный вариант (SOFA-HDV-Rz1498A76), в котором Мутация C в A в положении 76 в его остове отключает его способность к расщеплению ²⁸ ( ). SOFA-HDV-Rz1498A76 существенно не ингибировал продукцию ВИЧ-1 при уровнях экспрессии, аналогичных SOFA-HDV-Rz1498 ( ), что позволяет предположить, что каталитическое расщепление Rz в первую очередь отвечает за эффекты SOFA-HDV-Rz1498.Не наблюдалось влияния на инфекционность вируса из клеток, экспрессирующих SOFA-HDV-Rz1498 (дополнительная фигура S2 ), что позволяет предположить, что Rz снижает количество продуцируемого вируса, но не влияет на качество вирионов.

Влияние вариантов SOFA-HDV-Rz1498 на продукцию ВИЧ-1. ( a ) Схематическое изображение целевого сайта SOFA-HDV-Rz1498 (T) и вариантов (Rz). SOFA-HDV-Rz1498A76 имеет мутацию C в A в основной цепи Rz, -Rz1498Bs1 и -Rz1498Bs2 имеют один или два варианта нуклеотидов (nt) в биосенсоре (Bs), указанные в нижнем регистре.(b ) Эффекты каждого варианта SOFA-HDV-Rz1498 на продукцию вируса в клетках HEK293T оценивали точно так же, как в . Rz оценивали по крайней мере в трех независимых экспериментах с одной-тремя повторными трансфекциями (представлены как среднее ± SEM, n = 6-10). Относительная экспрессия контроля нагрузки Rz и 5S РНК для различных условий показана ниже для одного из двух независимых экспериментов, проведенных на клетках HEK293T, высеянных в 12-луночный планшет и котрансфицированных удвоенным количеством ДНК, использованной для оценки продукции вируса в 24-луночные планшеты.( c ) Активность однооборотного расщепления in vitro для SOFA-HDV-Rz1498, -Rz1498Bs1 и -Rz1498Bs2 определяли в разное время инкубации с малой субстратной РНК (Rz >> субстрат). % Расщепления измеряли путем деления продуктов расщепления на продукты расщепления + нерасщепленные продукты, количественно определяя по полосам на геле. Уравнение нелинейной регрессии с однофазной экспоненциальной ассоциацией с аппроксимацией методом наименьших квадратов (обычным) было определено с использованием призмы Graph Pad Prism для различных Rzs. Все точки данных представляют собой два независимых эксперимента и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 2).Средние константы скорости ( k _obs ) и максимальные значения расщепления ( F _max ) для SOFA-HDV-Rz представлены в таблице.

вариантов SOFA-HDV-Rz1498 с одиночной или двойной мутацией в их последовательности биосенсора (Bs) также были созданы для оценки способности SOFA-HDV-Rz1498 выдерживать несовпадения со своей мишенью (SOFA-HDV-Rz1498Bs1 и SOFA- HDV-Rz1498Bs2, ). Ни один из вариантов не ингибировал продукцию ВИЧ-1 ( ), что позволяет предположить, что действие SOFA-HDV-Rz1498 очень чувствительно к несовпадению с его мишенью.Несоответствующие Rzs имели аналогичные константы скорости расщепления in vitro ( k _obs ) со значительно сниженными значениями максимального расщепления ( F _max ) ( ), что свидетельствует об их неспособности ингибировать ВИЧ-1. продукция в клетках связана со сниженной способностью расщеплять свою цель.

КшРНК, нацеленная на сайт 1498, является мощным ингибитором продукции ВИЧ-1 и обеспечивает аддитивный эффект в комбинации с SOFA-HDV-Rz1498

Для оценки потенциала других антисмысловых молекул, нацеленных на сайт-мишень SOFA-HDV-Rz1498, в отношении ингибировать продукцию ВИЧ-1, мы разработали shRNA1498.Согласно нашим оценкам сохранения, каждый нуклеотид в целевом сайте shRNA1498 был консервативен на> 80% ( , Gag). По сравнению с бессмысленной shRNA (shRNAns), а также SOFA-HDV-Rz1498 и его контролями shRNA1498 обеспечивала почти полное ингибирование вирусной продукции ( ). Это ингибирование коррелировало со снижением внутриклеточной экспрессии полипротеина Gag ВИЧ-1 и одного из продуктов его процессинга, капсида (CA). Неожиданно, снижение экспрессии CA было гораздо более выраженным для Rz и shRNA по сравнению с их эффектами на экспрессию Gag.Аналогичный эффект наблюдался для shRNAs, нацеленных на последовательности в 5’UTR и Tat / Rev кодирующих последовательностях РНК ВИЧ-1 (дополнительная фигура S3 ), что позволяет предположить, что она не является специфичной для shRNA, нацеленной на последовательность Gag 1498.

Влияние shRNA1498 на продукцию ВИЧ-1 ( a ) Последовательности, нацеленные на shRNA1498 и контрольные shRNA, нацеленные на РНК ВИЧ-1 (shRNA522, shRNA553 и shRNA5983) показаны в связи с нашими оценками сохранения на уровне nt из Supplementary Файл S1 .(b ) Эффекты shRNA1498 и бессмысленной shRNA (shRNAns) на вирусную продукцию в клетках HEK293T оценивали точно так же, как в . Rzs и shRNA оценивали по крайней мере в трех независимых экспериментах с одной-тремя повторными трансфекциями (представлены как среднее ± SEM, n = 6-10). Относительная внутриклеточная экспрессия полипротеина Gag ВИЧ-1 (Gag, p55), промежуточных белков матрикс-капсид (MA-CA, p39) и белков капсида (CA, p24), а также контроль нагрузки GAPDH показаны ниже для одного из двух независимых эксперименты, проведенные на клетках HEK293T, высеянных в 12-луночный планшет и котрансфицированных удвоенным количеством ДНК, используемым для оценки продуцирования вирусов.Относительные интенсивности полос для Gag и CA были рассчитаны с использованием программного обеспечения Image J и выражены в виде доли интенсивности Gag в контрольной полосе SOFA-HDV-RzHBV. ( c ) Эффективность shRNA оценивали путем котрансфекции клеток HEK293T, высеянных в 24-луночный планшет, 100 нг ДНК pNL4-3 и 1-750 нг плазмид, экспрессирующих shRNA. Для более низких количеств плазмидной ДНК shRNA (1–500 нг) котрансфекция была доведена до 850 нг общей ДНК путем добавления нерелевантной плазмиды (pBluescript SK +, Stratagene, La Jolla, CA).Измерения относительной активности RT были преобразованы в логарифмически, и логарифм нелинейной регрессии (ингибитор) по сравнению с уравнением ответа с наименьшими квадратами (обычным) был определен с использованием Graph Pad Prism для различных shRNA. Значения ЕС50 из этого уравнения упоминаются в тексте. Все точки данных представляют по крайней мере два независимых эксперимента с двумя-тремя повторами и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 4-8). ( d ) Комбинации плазмид, экспрессирующих SOFA-HDV-Rz и shRNA, оценивали на клетках HEK293T, высеянных в 24-луночные планшеты и котрансфицированных 100 нг pNL4-3, 10 нг плазмиды, экспрессирующей shRNA, и 1 мкг плазмиды, экспрессирующей Rz.Данные были нормализованы для котрансфекции 100 нг pNL4-3 с 1 мкг пустой экспрессионной плазмиды Rz / shRNA и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из двух независимых экспериментов, выполненных в трех повторностях ( n = 6).

Чтобы сравнить эффективность shRNA1498 с другими кандидатами shRNA, мы разработали shRNA522 и shRNA553, смоделированные на основе ранее охарактеризованных siRNAs ²⁰ и shRNAs ²² , нацеленных на 5’UTR ( , ‘UTR) и shRNA5983 после конструкции, находящейся в клинической разработке, нацеленной на кодирующую последовательность экзона 1 Tat / Rev ²⁹ ( , Tat / Rev).Все четыре кшРНК ингибировали продукцию ВИЧ-1 ( ). Эффективность shRNA1498 была сравнима с эффективностью shRNA553 и shRNA5983, с эффективными концентрациями 50% (EC50) для плазмид shRNA ниже 5 нг входной ДНК, тогда как shRNA522 была гораздо менее эффективной со значением EC50 702 нг.

Чтобы оценить возможность использования shRNA1498 и shRNA5983 в комбинации с SOFA-HDV-Rz1498, мы котрансфицировали клетки HEK293T pNL4-3 ВИЧ-1 и различными комбинациями Rz и shRNA ( ).Чтобы количественно оценить эффект комбинаций, мы выбрали входной уровень shRNA ДНК, который не полностью подавлял вирусную продукцию в . В комбинации как с shRNA1498, так и с shRNA5983, SOFA-HDV-Rz1498 обеспечивает дополнительное ингибирование продукции ВИЧ-1 по сравнению с контрольным Rz, SOFA-HDV-Rz-HBV. Уровень ингибирования был аналогичен его эффекту при котрансфекции отдельно (50%) ( ), что позволяет предположить, что Rz может обеспечивать аддитивный эффект в сочетании как с shРНК, нацеленной на тот же сайт (shRNA1498), так и с shRNA, нацеленной на другой сайт. (shRNA5983).

SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498 ингибируют вирусную продукцию из различных штаммов ВИЧ-1

Поскольку целевой сайт Gag 1498 был доступен для ингибирования как Rz, так и shРНК в штамме ВИЧ-1 NL4-3, мы затем оценили, насколько это ингибирование распространялось на различные вирусные штаммы, представляющие подтип B (Mal ³⁰ и AD8 ³¹ ), C (Indie-C1 ³² и MJ4 ³³ ), D (94UG114 ³⁴ ) и циркулирующую рекомбинантную форму (CRF ) 02_AG (97GH-AG1 ³⁵ ).SOFA-HDV-Rz1498 ингибировал продукцию ВИЧ-1 вирусными штаммами (Mal, AD8, MJ4 и 97GH-AG1) с вариантами nt, расположенными рядом с их сайтами-мишенями, по сравнению с NL4-3 ( ), что позволяет предположить, что структура целевой сайт одинаково доступен для Rz в этих штаммах. В соответствии с результатами, полученными с использованием вариантов сайта связывания SOFA-HDV-Rz ( , -Bs1 и -Bs2), SOFA-HDV-Rz1498 не ингибировал продукцию ВИЧ-1 из штаммов Indie-C1 и 94UG114, которые несут вариант с одним нуклеотидом. в их сайтах связывания Bs ( ).Напротив, shRNA1498 ингибирует продукцию ВИЧ-1 из всех штаммов, что позволяет предположить, что она может переносить одно несовпадение нуклеотидов в своем сайте связывания в положении 17 и может ингибировать продукцию ВИЧ-1 в различных штаммах.

Ингибирование продукции ВИЧ-1 из различных вирусных штаммов с помощью SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498. ( a ) Последовательность внутри и вокруг сайта-мишени shRNA1498 и SOFA-HDV-Rz1498 показана для NL4-3 ВИЧ-1 ({“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text” : “M19921”, “term_id”: “296556485”, “term_text”: “M19921”}} M19921), MAL ({“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: “K03456” , “term_id”: “328018”, “term_text”: “K03456”}} K03456), AD8 ({“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: “AF004394”, “term_id” : “2281652”, “term_text”: “AF004394”}} AF004394), Indie-C1 ({“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: “AB023804.1 “,” term_id “:” 6016887 “,” term_text “:” AB023804.1 “}} AB023804.1), MJ4 ({” type “:” entrez-нуклеотид “,” attrs “: {” text “:” AF321523 “,” term_id “:” 13172878 “,” term_text “:” AF321523 “}} AF321523), 94UG114 ({” type “:” entrez-нуклеотид “,” attrs “: {” text “:” U88824.1 ” , “term_id”: “2570307”, “term_text”: “U88824.1”}} U88824.1) и 97GH-AG1 ({“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: «AB049811.1», «term_id»: «13517082», «term_text»: «AB049811.1»}} AB049811.1). Перекрывающийся целевой сайт для shRNA1498 и SOFA-HDV-Rz1498 выделен синим цветом, причем оба Сайты связывания RD (7 нуклеотидов (нуклеотидов)) и Bs (10 нуклеотидов) подчеркнуты.Вариации Nt по сравнению с ВИЧ-1 NL4-3 выделены красным, а начальная и конечная позиции для каждой последовательности показаны в соответствии с их аннотацией в Genbank. (b ) Эффекты SOFA-HDV-Rz1498, shRNA1498 и их контролей на продукцию ВИЧ-1 из различных молекулярных клонов в клетках HEK293T оценивали точно так же, как в , по крайней мере в двух независимых экспериментах, каждый из которых включает две-три повторности. трансфекции (указано как среднее ± SEM, n = 4–10).

SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498 обладают минимальным нецелевым воздействием на человеческие РНК

Потенциал воздействия SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498 на экспрессию человеческих мРНК затем оценивался на клетках HEK293T, котрансфицированных pNL4 ВИЧ-1. -3.Перед составлением профиля экспрессии генов ингибирование продуцирования вирусов было подтверждено для каждого состояния (данные не показаны) и согласовано с результатами, представленными в . Эксперименты на микрочипах выполняли в трех повторностях замены красителей, и результаты выражали как отношение log2 SOFA-HDV-Rz1498 или shRNA1498 по сравнению с клетками, котрансфицированными пустым вектором (дополнительная фигура S4 ). Все средние отношения log2 были низкими (ниже 1,0), что свидетельствует о том, что и SOFA-HDV-Rz1498, и shRNA1498 могут ингибировать продукцию ВИЧ-1 с минимальным влиянием на экспрессию мРНК человека.Отношения log2 для мРНК с наибольшей степенью повышающей или понижающей регуляции проиллюстрированы в и перечислены в Supplementary File S2 . Некоторые из этих мРНК были обнаружены как в условиях SOFA-HDV-Rz1498, так и в условиях shRNA1498, что позволяет предположить, что часть наблюдаемых изменений может быть специфичной для сайта-мишени.

Изменения экспрессии генов в клетках, трансфицированных SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498. Клетки HEK293T высевали в 12-луночные планшеты и котрансфицировали ВИЧ-1 pNL4-3 (150 нг) и либо SOFA-HDV-Rz1498, shRNA1498, либо пустой плазмидой экспрессии Rz / shRNA (1.5 мкг). Через сорок восемь часов после трансфекции общую РНК собирали и анализировали с помощью микромассивов. Показаны отношения log2 мРНК с наибольшей разницей между клетками, трансфицированными SOFA-HDV-Rz1498 или shRNA1498, и клетками, трансфицированными пустым вектором экспрессии. РНК, регуляция которых была повышена или понижена в обоих условиях, показаны зеленым и красным цветом соответственно. Один ген, который подавлялся SOFA-HDV-Rz1498 и усиливался shRNA1498, показан желтым. Идентификационные данные генов и значения отношения log2 представлены в дополнительном файле S2 .

SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498 ингибируют репликацию ВИЧ-1 в клеточной линии Т-лимфоцитов

Для оценки способности SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498 ингибировать репликацию ВИЧ-1 мы трансфицировали Т-клетки Jurkat с помощью тех же конструкций. использовали для их доставки в клетки HEK293T и отбирали стабильно трансфицированные клетки в присутствии зеоцина. Все клеточные линии имели сходное распределение экспрессии GFP из интегрированных плазмид и пролиферировали на аналогичных уровнях (, дополнительная фигура S5, ).После инфицирования ВИЧ-1 NL4-3 клетки, экспрессирующие SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498, имели более низкий уровень вирусной репликации по сравнению с клетками, экспрессирующими контрольные молекулы, SOFA-HDV-RzHBV и shRNAns ( ). Умеренное подавление вирусной репликации также наблюдалось в клетках, экспрессирующих каталитически неактивный Rz (SOFA-HDV-Rz1498A76). Эти результаты предполагают, что в дополнение к его доступности в клетках HEK293T, сайт-мишень Gag 1498 также доступен для ингибирования как SOFA-HDV-Rz, так и shRNA в линии Т-лимфоцитов.

Ингибирование репликации ВИЧ-1 с помощью SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498. ( a ) Т-клетки Jurkat, стабильно трансфицированные указанными SOFA-HDV-Rz и shРНК, инфицировали ВИЧ-1 NL4-3. Средняя активность ОТ (имп / мин / мкл) в супернатантах культур по четырем независимым инфекциям, проведенным в трех повторностях ( n = 12), показана в течение 10 и 14 дней после заражения. ( b ) Динамика репрезентативной инфекции ( n = 3) до 32 дней после заражения.

Обсуждение

Rzs, нацеленные на РНК ВИЧ-1, были среди первых агентов генной терапии, испытанных в клинических условиях, ³⁶ и единственным агентом, испытанным в испытании фазы II с векторным контролем. ³⁷ Хотя в этом исследовании не было обнаружено токсичности, сообщенный умеренный эффект подчеркивает необходимость поиска большего количества ингибирующих молекул для использования в генной терапии. Подходы, которые были описаны для идентификации новых кандидатов Rz, включают использование (i) промоторов РНК-полимеразы III (Pol III) для достижения более высоких уровней экспрессии, ^38,39 (ii) клеточного скрининга для определения оптимальных сайтов-мишеней, ^{18 , 19} (iii) химерные Rzs для усиления противовирусных эффектов, ^18,27,40,41 и (iv) альтернативные мотивы, такие как модифицированная РНКаза P и HDV Rzs. ^7,16 В этом исследовании мы проверили SOFA-HDV-Rzs, экспрессируемые с промотора h2 РНК Pol III, нацеленные на 5’UTR и кодирующую последовательность Gag РНК ВИЧ-1 на предмет воздействия на продукцию вирусов. Было идентифицировано несколько Rz-кандидатов-кандидатов с потенциалом нацеливания на широкий спектр штаммов ВИЧ-1 ( ), и один из них (SOFA-HDV-Rz1498) был особенно эффективным ингибитором продукции ВИЧ-1 ( ). В соответствии с другими скринингами Rz, ^17,18,19 , где только небольшое количество Rz из библиотеки кандидатов было эффективным, большинство оцениваемых SOFA-HDV-Rz не сильно ингибировали продукцию ВИЧ-1.Одним из объяснений этого может быть то, что Rzs могут быть особенно чувствительны к доступности своих сайтов-мишеней и что большинство сайтов-мишеней в РНК ВИЧ-1 не позволяют Rzs связываться и формировать соответствующую структуру, необходимую для катализа. Другие объяснения включают неспособность большинства Rz правильно складываться или локализоваться с их целевой РНК.

Согласно вторичной структуре, опубликованной для полноразмерной геномной РНК ВИЧ-1 NL4-3, ⁴² целевой сайт, который мы идентифицировали в кодирующей последовательности Gag, находится преимущественно в одноцепочечной петле длиной 27 нуклеотидов, пронумерованной от 1033 до 1059 на основе о его положении в NL4-3 РНК ВИЧ-1 (с 1487 по 1513 в ДНК NL4-3).Помимо того, что он доступен для ингибирования с помощью SOFA-HDV-Rz, целевой сайт 1498 был также доступен для shRNA, с аналогичной эффективностью в анализе продукции ВИЧ-1 по сравнению с ранее описанными кандидатами shRNA ( ). Хотя и SOFA-HDV-Rz1498, и shRNA1498 нацелены на один и тот же сайт, наши результаты показали, что их можно использовать вместе для ингибирования вирусной продукции с аддитивным эффектом, сравнимым с комбинацией SOFA-HDV-Rz1498 с shRNA5983, нацеленной на другой сайт ( ).Эти результаты совместимы с SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498, действующими в разных клеточных компартментах, обеспечивая неизбыточный эффект на продукцию ВИЧ-1. В соответствии с этим было показано, что Rzs, экспрессируемые с промотора U6 РНК Pol III, локализуются преимущественно в ядре, ³⁸ , в то время как shRNAs экспортируются в цитоплазму через экспортно-5-зависимый путь.

Как для SOFA-HDV-Rz1498, так и для shRNA1498, ингибирование внутриклеточной экспрессии CA было более очевидным, чем ингибирование Gag ( ), и аналогичный эффект наблюдался для shРНК, нацеленных на 5’UTR и перекрывающуюся рамку считывания Tat / Rev ( Дополнительный рисунок S3 ).Возможно, что в этих экспериментах и ​​Rz, и shRNA ингибируют внутриклеточный процессинг Gag белка CA, механизм, который был описан как способствующий ингибированию продукции ВИЧ-1, обеспечиваемой модифицированными мяРНК U1. ⁴³ Другая возможность состоит в том, что внутриклеточный Gag более стабилен по сравнению с CA в этих экспериментах, что делает влияние на экспрессию CA более очевидным во время оценки выборки. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы оценить, воспроизводится ли этот эффект в различных типах клеток и в экспериментальных условиях, и определить, может ли он быть механизмом, способствующим ингибированию вирусной продукции, обеспечиваемой Rz и shРНК, нацеленной на РНК ВИЧ-1.

Важным моментом при разработке методов лечения ВИЧ-1 является то, что они нацелены на большинство циркулирующих штаммов ВИЧ-1. По нашим оценкам, целевой сайт как для SOFA-HDV-Rz-1498, так и для shRNA1498 был высококонсервативным на уровне нуклеотидов ( , Gag). Набор данных LANL, который мы использовали для получения наших оценок, состоял из 1850 полных последовательностей ВИЧ-1 по сравнению с 170 и 495 в более ранних исследованиях, которые использовали этот набор данных для идентификации shRNA ²¹ или siRNA ²⁰ целевых сайтов, соответственно.Сравнение распределения подтипов между набором данных LANL, который мы использовали, и глобальными оценками ⁴⁴ (дополнительный рисунок S1 ) предполагает, что подтип C ВИЧ-1 недостаточно представлен в наборе данных LANL, в то время как подтип B, уникальные рекомбинантные формы (URF) и все CRF, кроме AG или AE, перепредставлены. Набор данных LANL, хотя и не совсем репрезентативный для глобального распределения, включает все опубликованные последовательности ВИЧ-1 с представителями всех основных подтипов и циркулирующих рекомбинантных форм и может легко использоваться для получения оценок консервации на уровне nt для идентификации антисмысловых сайтов-мишеней. ⁴⁵ Помимо того, что наши результаты являются высококонсервативными для различных последовательностей, доступных в базе данных LANL, наши результаты позволяют предположить, что целевой сайт 1498 также может иметь консервативную структуру, поскольку эффекты shRNA1498 были аналогичными по отношению к различным вирусным штаммам с вариациями последовательностей в пределах и вокруг целевой площадки ( ).

Еще одним важным фактором при разработке антисмысловых молекул, нацеленных на РНК ВИЧ-1, является их способность нацеливаться на клеточные РНК с комплементарными сайтами-мишенями.Хотя сайты-мишени можно сравнить с геномом человека, не всегда возможно предсказать нецелевые эффекты, поскольку многие антисмысловые технологии не требуют идеально согласованных сайтов-мишеней. В соответствии с исследованиями in vitro, , ^9,10 несоответствие одного нуклеотида в SOFA-HDV-Rz1498 ( ) или его сайте связывания (штамм Indie-C1 и 94UG114, ) сильно повлияло на его способность ингибировать ВИЧ. -1 продукция. Напротив, несовершенно согласованная snoRNA, связанная с головкой молотка Rz, нацеленная на РНК ВИЧ-1, была эффективным ингибитором продукции ВИЧ-1 ¹⁸ , и было показано, что несколько shRNA выдерживают одиночные и даже двойные несовпадения в РНК ВИЧ-1. ^25,46 В соответствии с предыдущими результатами ²⁵ несоответствие одного нуклеотида в положении 17 не влияло на ингибирование вирусной продукции, обеспечиваемой shRNA1498 (штамм Indie-C1 и 94UG114, ), что позволяет предположить, что SOFA-HDV-Rz являются более чувствительны к несовпадениям в их сайтах-мишенях по сравнению с shRNA. Хотя эта чувствительность была бы полезной с точки зрения ограничения побочных эффектов, она способна воздействовать на более широкий спектр циркулирующих штаммов ВИЧ-1 и сделает SOFA-HDV-Rz более чувствительными к появлению резистентного вируса в терапевтических условиях. .На уровнях, на которых и SOFA-HDV-Rz1498, и shRNA1498 ингибировали продукцию ВИЧ-1, наблюдались только небольшие изменения в экспрессии генов ( , Дополнительная фигура S4 ), что позволяет предположить, что их целевой сайт может в значительной степени отличаться от последовательностей РНК человека для Избегайте серьезных нецелевых эффектов на мРНК человека. В сочетании с его эффективностью и воздействием на различные штаммы ВИЧ-1, в дополнение к нашим прогнозам сохранения последовательности, эти результаты предполагают, что shRNA1498 имеет потенциал для безопасного и эффективного использования против широкого спектра циркулирующих штаммов ВИЧ-1 в терапевтических условиях. .Планируются дальнейшие исследования для прямого сравнения безопасности и эффективности shRNA1498 с другими кандидатами на shRNA в более подходящих клеточных линиях и моделях инфекции ВИЧ-1.

Хотя SOFA-HDV-Rz1498 был более эффективным, чем наши ранее разработанные кандидаты, нацеленные на область Tat / Rev РНК ВИЧ-1, он достиг только 50% ингибирования продукции вируса в анализах котрансфекции по сравнению с почти полным ингибированием при гораздо более низких уровнях. по shRNA1498 ( , ). Напротив, он продемонстрировал аналогичный потенциал для поддержки устойчивого ингибирования репликации вируса в Т-клетках Jurkat ( ), что свидетельствует о долгосрочном сохранении его эффектов в модели инфекции.Улучшения в конструкции или экспрессии SOFA-HDV-Rz1498 могут дополнительно повысить его эффективность, и рассматриваются модификации, чтобы сделать его менее чувствительным к мутациям в его целевом сайте. В целом, наши результаты предполагают, что и SOFA-HDV-Rz-1498, и shRNA1498 могут быть дополнительно разработаны для экспрессии в условиях генной терапии или путем прямой доставки с помощью недавно разработанных методов ⁴ в качестве РНК-препаратов.

Материалы и методы

Идентификация in silico целевых сайтов SOFA-HDV-Rz. Использование набора данных LANL для оценки сохранения последовательности на уровне nt было описано ранее. ⁴⁵ Вкратце, множественное выравнивание всех полных последовательностей ВИЧ-1 было загружено из базы данных LANL с помощью инструмента QuickAlign, а консенсусная последовательность с% сохранения в каждой позиции была сгенерирована с помощью редактора последовательностей Jalview ⁴⁷ и экспортирована в Microsoft Excel ( Дополнительный файл S1 , вкладка сырых данных). Несколько позиций в консенсусной последовательности были представлены только в небольшом количестве последовательностей, и позиции, которые встречались менее чем в 10% последовательностей, были удалены из необработанных данных, чтобы облегчить выбор целевого сайта ( дополнительный файл S1 , вкладка оценок сохранения).Высококонсервативные целевые сайты были выбраны на основе критериев, проиллюстрированных в . Затем использовали нуклеотид BLAST ⁴⁸ для выравнивания сайтов-мишеней с NL4-3 ВИЧ-1 ({“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: “M19921”, “term_id”: “296556485). “,” term_text “:” M19921 “}} M19921) и программное обеспечение Ribosubstrates (http://www.riboclub.org/ribosubstrates) было использовано для оценки потенциала соответствующих SOFA-HDV-Rzs для нацеливания на человеческие РНК, как описано ранее. . ²⁶ Вкратце, программа идентифицирует потенциальные сайты-мишени для SOFA-HDV-Rz в базе данных кДНК, позволяя варьировать длину спейсерной последовательности и биосенсора ( ).Идеально подобранным целевым сайтам присваивается значение 0, и оценка увеличивается на 10 для каждой пары оснований колебания и на 100 для каждого несоответствия. Мы установили значение 20 в качестве отсечки для потенциальных эффектов вне мишени, представляющее по крайней мере две пары оснований колебания между SOFA-HDV-Rz, нацеленной на РНК ВИЧ-1, и потенциальным сайтом-мишенью в любой РНК человека.

Конструкция плазмиды. Все Rz и shRNA SOFA-HDV экспрессировались с промотора h2 РНКазы P человека в векторе psiRNA-h2GFP :: Zeo (InvivoGen, San Diego, CA).Вставки SOFA-HDV-Rz были созданы с использованием стратегии перекрывающейся ПЦР ^11,14,28 , а вставки shRNA были созданы путем отжига комплементарных олигонуклеотидов. Последовательности для вставок shRNA522 и shRNA553 были получены из предыдущего исследования ²² , и с использованием идентичного дизайна были разработаны shRNAns (бессмыслица, адаптированная из siControl ²⁰ ), shRNA5983 (адаптированная из sh2 ⁴⁹ ) и вставки shRNA1498. Стратегии клонирования и последовательности всех олигонуклеотидов, используемых для создания плазмидных вставок, представлены в дополнительных материалах и методах , вариабельные последовательности ДНК SOFA-HDV-Rz проиллюстрированы в дополнительной таблице S1 .

Передачи. Котрансфекции молекулярных клонов ВИЧ-1 плазмидами, экспрессирующими Rz или shRNA, проводили в 24- или 12-луночных планшетах, как указано в подписях к рисункам. Условия культивирования клеток описаны в Дополнительные материалы и методы . За двадцать четыре часа до трансфекции клетки HEK293T высевали из расчета 2 × 10 ⁵ клеток / мл и трансфекции проводили с использованием реагента TransIT (Mirus, Madison, WI) в соответствии с инструкциями производителя.Продукция вируса оценивалась через 48 часов после трансфекции путем измерения активности ОТ ВИЧ-1 в культуральном супернатанте. Чтобы учесть различия в вирусной продукции между экспериментами, реплики для каждой оцениваемой конструкции выполняли параллельно с пустым вектором psiRNA-h2GFP :: Zeo, и все данные выражали в виде процента вирусной продукции в пустых векторных котрансфецированных клетках (относительная RT-активность ). Для каждой оцениваемой конструкции Rz или shRNA мы также включили нерелевантный контрольный SOFA-HDV-Rz-HBV или нонсенс-контроль shRNAns, соответственно.

Экспрессия Rz в клетках HEK293T. Экстракты тотальной РНК собирали из трансфицированных клеток с использованием реагента Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Десять микрограммов общей РНК разделяли на 8% денатурирующем полиакриламидном геле, переносили на нейлоновую мембрану (AmershamHybond-N +, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) и подвергали поперечной сшивке под действием УФ-излучения. Мембраны инкубировали с ProbeSOFA, а затем с Probe5S и визуализировали с использованием фосфорного экрана.Последовательности зондов, маркировка и подробные сведения об условиях нозерн-блоттинга представлены в дополнительных материалах и методах .

Анализ расщепления SOFA-HDV-Rz in vitro. Условия однократного оборота (Rz >> субстрат) использовали для оценки каталитической активности SOFA-HDV-Rzs, как описано ранее. ²⁸ Вкратце, следовые количества субстрата, меченного 5′-концом (<1 нмоль / л), инкубировали при 37 ° C с конечной концентрацией 100 нмоль / л выбранного SOFA-HDV-Rz.Реакции расщепления инициировали добавлением MgCl ₂ , образцы отбирали через различные интервалы времени и останавливали загрузочным буфером. Извлеченные образцы разделяли на 20% денатурирующем полиакриламидном геле, визуализировали с помощью люминесцентного экрана и количественно оценивали с помощью программного обеспечения ImageQuant (Molecular Dynamics, Саннивейл, Калифорния). Контрольную реакцию проводили в отсутствие Rzs (замененного водой), и его образец последнего временного интервала использовали для вычитания фона. Для каждой временной точки рассчитывали процент расщепления (количество продуктов расщепления превышает количество продуктов расщепления и нерасщепленных продуктов).Подробная информация о шаблонах ДНК, используемых для транскрипции in vitro , синтеза РНК и мечения, представлена ​​в дополнительных материалах и методах . Затем были рассчитаны k _obs и F _max с использованием GraphPad Prism 5 для каждого Rz. Скорость расщепления ( k _obs ) была получена путем аппроксимации данных уравнением F _t = F _max (1 – e ^{– kt} ), где F _t – процент расщепления во время t , F _max – максимальный процент расщепления, а k – константа скорости ( k _obs ).

Экспрессия белка ВИЧ-1 в клетках HEK293T. Выявление экспрессии белка ВИЧ-1 с использованием антитела р24 ВИЧ-1 в клетках HEK293T было описано ранее. ⁵⁰ Вкратце, 100 мкг общего белка разделяли на 10% денатурирующем полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Мембраны сначала инкубировали с анти-HIVp24 (183-h22-5C), а затем с анти-GAPDH (sc-32233, Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас), полосы визуализировали с помощью ECL (GE Healthcare).Относительную интенсивность полос рассчитывали с использованием программного обеспечения для денситометрии Image J (версия 1.48, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд). Данные выражены в виде интенсивности полос Gag или CA относительно интенсивности полосы Gag на дорожках контрольных SOFA-HDV-RzHBV ( ) или shRNAns ( Дополнительная фигура S3 ).

Профили экспрессии генов в клетках HEK293T. Уровни экспрессии генов относительно контрольных трансфекций анализировали с помощью микроматриц экспрессии генов человека (патентованные слайды ACRI).Трехкратные эксперименты с заменой красителя описаны в Дополнительные материалы и методы .

Анализ на ВИЧ-1. Стабильные Т-лимфоциты Jurkat получали электропорацией конструкций псиРНК с последующей селекцией с использованием зеоцина (InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния). Относительную экспрессию конструкций псиРНК в стабильных популяциях клеток оценивали путем измерения экспрессии GFP из интегрированного вектора с помощью проточного цитометра FACS Calibur (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), а пролиферацию определяли путем подсчета живых клеток с помощью трипанового синего (Wisent , Сент-Бруно, Канада) исключение с помощью гемоцитометра.Перед инфицированием клетки, экспрессирующие SOFA-HDV-Rz или shRNA, высевали в шестилуночные планшеты из расчета 2 × 10 ⁵ клеток на лунку. Репликацию вируса контролировали путем измерения активности ОТ в супернатантах культур в различные дни после заражения. Культивирование клеток и условия отбора описаны в дополнительных материалах и методах .

Анализ ОТ ВИЧ-1. Анализ ОТ ВИЧ-1, использованный в этом исследовании, выполняли, как описано ранее. ⁴⁵ Вкратце, 5 мкл супернатанта инкубировали с матрицей полиадениловой кислоты (Roche, Базель, Швейцария), праймером oligodT (Life Technologies) и [ ³² P] -dTTP (3000 Ки / ммоль, Perkin Elmer, Waltham , MA) в течение 2 часов при 37 ° C в 50 мкл общей реакционной смеси.Затем пять микролитров реакционной смеси наносили каплями на диэтиламиноэтиловый (DEAE) фильтрующий материал (Perkin Elmer, Waltham, MA) и пять раз промывали 2X буфером SSC с последующими двумя промываниями в 95% этаноле для удаления [ ³² P] – dTTP не включен в продукт poly dT RT. Количество отсчетов в минуту (имп / мин) рассчитывали для каждого образца с использованием сцинтилляционного счетчика микропланшетов (MicrobetaTriLux, Perkin Elmer), и они пропорциональны количеству фермента ОТ ВИЧ-1, присутствующего в реакционной смеси.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ Рисунок S1. Распределение подтипов последовательностей ВИЧ-1, используемых для расчета оценок сохранения в сравнении с оценками глобального распределения. Рисунок S2. Влияние SOFA-HDV-Rz1498 на качество вирионов, полученных из котрансфицированных клеток HEK293T. Рисунок S3. Экспрессия белка Gag и капсида в клетках, котрансфицированных pNL4-3 ВИЧ-1 и различными shРНК, нацеленными на РНК ВИЧ-1. Рисунок S4. Изменение соотношений экспрессии мРНК по сравнению с контрольным вектором для клеток HEK293T, трансфицированных SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498. Рисунок S5. Анализ стабильных клеточных линий Jurkat. Таблица S1. SOFA-HDV-Rz сайтов-мишеней и кодирующие последовательности ДНК. Файл S1. Данные для оценки сохранения последовательности. Файл S2. Значительно увеличивающая и подавляющая идентичность генов и отношения log2 в трансфицированных клетках HEK293T для SOFA-HDV-Rz1498 или shRNA1498 по сравнению с пустой плазмидой экспрессии Rz (psiRNA). Материалы и методы

Благодарности

Авторы благодарят Даниэля Леже (Атлантический научно-исследовательский институт рака) за сетку и анализ данных микроматрицы, Дайан Сингрой и Тибо Меспледе из лаборатории Марка Вайнберга (Университет Макгилла) за помощь в выборе и предоставлении молекулярных клонов ВИЧ-1 и Саманте Буругу (Университет Макгилла) за рецензию на рукопись.Следующий реагент был получен через программу реагентов NIH AIDS Reagent Program, Отдел СПИДа, NIAID, NIH: p94UG114.1.6 (Full-Length) от Беатрис Хан и FengGao, а также Сети ЮНЭЙДС по изоляции и характеристике ВИЧ. Это исследование было поддержано Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR) (CIHR: HOP-93434 и DCB-120266 для A.G. и MOP-44022 для J.-P.P.): R.J.S, M.V.L. и S.M.D. были получателями стипендий Banting и Best Canada Graduate Scholarship, докторской стипендии от Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S) и стипендии Vanier Canada Graduate Scholarship соответственно.Ж.-П.П. занимал кафедру канадских исследований в области геномики и каталитической РНК, а в настоящее время является председателем Университета Шербрука по структуре и геномике АРН. Ж.-П.П. является членом Исследовательского центра клиники Этьен-Ле-Бель, а A.G. является членом Réseau SIDA-maladies Infectieuses из FRQ-S.

Дополнительный материал

Дополнительный рисунок S1

Распределение подтипов последовательностей ВИЧ-1, используемых для расчета оценок сохранения в сравнении с оценками глобального распределения.

Дополнительная фигура S2

Влияние SOFA-HDV-Rz1498 на качество вирионов, полученных из котрансфицированных клеток HEK293T.

Дополнительная фигура S3

Экспрессия белков Gag и капсида в клетках, котрансфицированных pNL4-3 ВИЧ-1 и различными shРНК, нацеленными на РНК ВИЧ-1.

Дополнительная фигура S4

Изменение соотношений экспрессии мРНК по сравнению с контрольным вектором для клеток HEK293T, трансфицированных SOFA-HDV-Rz1498 и shRNA1498.

Дополнительная фигура S5

Анализ стабильных клеточных линий Jurkat.

Дополнительная таблица S1

Целевые сайты SOFA-HDV-Rz и кодирующие последовательности ДНК.

Дополнительный файл S1

Данные для оценок сохранения последовательности.

Дополнительный файл S2

Идентичность генов и соотношения log2 в трансфицированных клетках HEK293T для SOFA-HDV-Rz1498 или shRNA1498 значительно повышаются и понижаются по сравнению с пустой плазмидой экспрессии Rz (psiRNA).

Дополнительные материалы и методы

Ссылки

• De Clercq E.Антиретровирусные препараты. Curr Opin Pharmacol. 2010; 10: 507–515. [PubMed] [Google Scholar]
• Le Douce V, Janossy A, Hallay H, Ali S., Riclet R, Rohr O, et al. Излечение от ВИЧ-инфекции: есть ли у нас основания для оптимизма? J Antimicrob Chemother. 2012; 67: 1063–1074. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Scherer LJ, Rossi JJ. Генная терапия ex vivo для лечения ВИЧ-1. Hum Mol Genet. 2011; 20 R1: R100 – R107. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Burnett JC, Rossi JJ.Терапия на основе РНК: текущий прогресс и перспективы на будущее. Chem Biol. 2012; 19: 60–71. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Haasnoot J, Berkhout B. Терапевтические средства на основе нуклеиновых кислот в борьбе с патогенными вирусами. Handb Exp Pharmacol. 2009. 189: 243–263. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rossi JJ. Рибозимная терапия при ВИЧ-инфекции. Adv Drug Deliv Rev.2000; 44: 71–78. [PubMed] [Google Scholar]
• Цзэн В., Чен Ю.К., Бай И., Транг П., Ву Г.П., Лу С. и др.Эффективное ингибирование репликации вируса иммунодефицита человека 1 с помощью сконструированного рибозима РНКазы P. PLoS ONE. 2012; 7: e51855. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Asif-Ullah M, Lévesque M, Robichaud G, Perreault JP. Разработка методов инактивации генов на основе рибозимов; на примере рибозима вируса гепатита дельта. Curr Gene Ther. 2007. 7: 205–216. [PubMed] [Google Scholar]
• Bergeron LJ, Perreault JP. Зависимый от цели переключатель включения / выключения повышает точность рибозима. Nucleic Acids Res.2005; 33: 1240–1248. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bergeron LJ, Reymond C, Perreault JP. Функциональная характеристика дельта-рибозима SOFA. РНК. 2005; 11: 1858–1868. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Robichaud GA, Perreault JP, Ouellette RJ. Разработка системы подавления генов, специфичных для изоформ: исследование транскрипционного элемента Pax-5B человека. Nucleic Acids Res. 2008; 36: 4609–4620. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• D’Anjou F, Routhier S, Perreault JP, Latil A, Bonnel D, Fournier I, et al.Молекулярная проверка PACE4 как мишени при раке простаты. Перевод Онкол. 2011; 4: 157–172. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Левеск М.В., Левеск Д., Бриер Ф.П., Перро Дж. Изучение нового поколения рибозимов для борьбы с ВГС. PLoS ONE. 2010; 5: e9627. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Motard J, Rouxel R, Paun A, von Messling V, Bisaillon M, Perreault JP. Новая профилактика на основе рибозима подавляет репликацию вируса гриппа А и защищает от тяжелого заболевания.PLoS ONE. 2011; 6: e27327. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Fiola K, Perreault JP, Cousineau B. Нацеливание на ген в грамположительной бактерии Lactococcus lactis с использованием различных дельта-рибозимов. Appl Environ Microbiol. 2006. 72: 869–879. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lainé S, Scarborough RJ, Lévesque D, Didierlaurent L, Soye KJ, Mougel M, et al. In vitro и in vivo расщепление РНК ВИЧ-1 новыми рибозимами SOFA-HDV и их способность ингибировать репликацию вируса.RNA Biol. 2011. 8: 343–353. [PubMed] [Google Scholar]
• Bramlage B, Luzi E, Eckstein F. LTR ВИЧ-1 в качестве мишени для синтетического рибозим-опосредованного ингибирования экспрессии гена: выбор сайта и ингибирование в культуре клеток. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 4059–4067. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Unwalla HJ, Li H, Li SY, Abad D, Rossi JJ. Использование библиотеки рибозима, содержащей U16 snoRNA, для идентификации мишеней рибозима в ВИЧ-1. Mol Ther. 2008; 16: 1113–1119. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Müller-Kuller T, Capalbo G, Klebba C, Engels JW, Klein SA.Идентификация и характеристика высокоэффективного рибозима «головка молотка» против ВИЧ. Олигонуклеотиды. 2009. 19: 265–272. [PubMed] [Google Scholar]
• Наито Ю., Нохтоми К., Оноги Т., Уениши Р., Уи-Тей К., Сайго К. и др. Оптимальный дизайн и валидация противовирусной siRNA для нацеливания на ВИЧ-1. Ретровирология. 2007; 4: 80. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• ter Brake O, Константинова П., Джейлан М., Беркхаут Б. Молчание ВИЧ-1 с помощью РНК-интерференции: подход с использованием множественных shRNA.Mol Ther. 2006; 14: 883–892. [PubMed] [Google Scholar]
• Макинтайр Дж. Дж., Гронеман Дж. Л., Ю. Ю. Х., Харамилло А., Шен С., Эпплгейт Т. Т. 96 shРНК предназначены для максимального охвата вариантов ВИЧ-1. Ретровирология. 2009; 6: 55. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• DeYoung MB, Hampel A. Компьютерный анализ сохранения и уникальности последовательностей ВИЧ, нацеленных на рибозимы. Методы Мол биол. 1997. 74: 27–36. [PubMed] [Google Scholar]
• Саджик Р., Ли К., Асаи К., Сакак Д., Бранч Д.Р., Аптон С. и др.Использование модифицированных мяРНК U1 для подавления репликации ВИЧ-1. Nucleic Acids Res. 2007. 35: 247–255. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lee SK, Dykxhoorn DM, Kumar P, Ranjbar S, Song E, Maliszewski LE, et al. Лентивирусная доставка коротких шпилечных РНК защищает CD4 Т-клетки от множественных клад и первичных изолятов ВИЧ. Кровь. 2005; 106: 818–826. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lucier JF, Bergeron LJ, Brière FP, Ouellette R, Elela SA, Perreault JP. RiboSubstrates: веб-приложение, посвященное специфике расщепления рибозимов в определенных геномах.BMC Bioinformatics. 2006; 7: 480. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Санчес-Луке Ф. Дж., Рейес-Дариас Дж. А., Пуэрта-Фернандес Э., Берзал-Херранц А. Ингибирование репликации и димеризации ВИЧ-1 с помощью двойных ингибирующих РНК. Молекулы. 2010; 15: 4757–4772. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lévesque MV, Perreault JP. Рибозим SOFA-HDV, индуцированный мишенью. Методы Мол биол. 2012; 848: 369–384. [PubMed] [Google Scholar]
• ДиДжиусто Д.Л., Кришнан А., Ли Л., Ли Х., Ли С., Рао А. и др.Генная терапия ВИЧ на основе РНК с использованием модифицированных лентивирусным вектором клеток CD34 (+) у пациентов, перенесших трансплантацию по поводу лимфомы, связанной со СПИДом. Sci Transl Med. 2010; 2: 36ra43. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Педен К., Эмерман М., Монтанье Л. Изменения в ростовых свойствах при пассаже в тканевой культуре вирусов, полученных из инфекционных молекулярных клонов ВИЧ-1LAI, ВИЧ-1MAL и ВИЧ -1ELI. Вирусология. 1991; 185: 661–672. [PubMed] [Google Scholar]
• Теодор Т.С., Энглунд Дж., Баклер-Уайт А., Баклер К.Э., Мартин М.А., Педен К.В.Конструирование и характеристика стабильного полноразмерного макрофаготропного молекулярного клона ВИЧ 1 типа, который направляет продукцию высоких титров вирионов потомства. AIDS Res Hum Retroviruses. 1996; 12: 191–194. [PubMed] [Google Scholar]
• Мотидзуки Н., Оцука Н., Мацуо К., Шиино Т., Кодзима А., Курата Т. и др. Инфекционный клон ДНК ВИЧ типа 1 подтипа C. Ретровирусы AIDS Res Hum. 1999; 15: 1321–1324. [PubMed] [Google Scholar]
• Ndung’u T, Renjifo B, Essex M. Создание и анализ инфекционного молекулярного клона вируса иммунодефицита человека типа 1 подтипа C.J Virol. 2001; 75: 4964–4972. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gao F, Robertson DL, Carruthers CD, Morrison SG, Jian B, Chen Y, et al. Исчерпывающая панель клонов почти полной длины и референсных последовательностей для изолятов вируса иммунодефицита человека, не относящихся к подтипу B, типа 1. J Virol. 1998. 72: 5680–5698. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Кусагава С., Такебе Ю., Янг Р., Мотомура К., Ампофо В., Брандфул Дж. И др. Выделение и характеристика полноразмерного молекулярного клона ДНК ганского рекомбинантного CRF02_AG, межподтипа A / G ВИЧ типа 1, который является репликационным в ограниченном диапазоне хозяев.AIDS Res Hum Retroviruses. 2001; 17: 649–655. [PubMed] [Google Scholar]
• Росси Дж. Дж., Июнь СН, Кон Д.Б. Генетические методы лечения ВИЧ. Nat Biotechnol. 2007. 25: 1444–1454. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Mitsuyasu RT, Merigan TC, Carr A, Zack JA, Winters MA, Workman C и др. Испытание фазы 2 генной терапии рибозима против ВИЧ в аутологичных клетках CD34 +. Nat Med. 2009. 15: 285–292. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Good PD, Krikos AJ, Li SX, Bertrand E, Lee NS, Giver L, et al.Экспрессия малых терапевтических РНК в ядрах клеток человека. Gene Ther. 1997; 4: 45–54. [PubMed] [Google Scholar]
• Пуэрта-Фернандес Э, Баррозо-дель Хесус А, Ромеро-Лопес С., Тапиа Н., Мартинес М.А., Берзал-Эрранц А. Ингибирование репликации ВИЧ-1 с помощью РНК, направленной против региона LTR. СПИД. 2005; 19: 863–870. [PubMed] [Google Scholar]
• Chang Z, Westaway S, Li S, Zaia JA, Rossi JJ, Scherer LJ. Повышенная экспрессия и ингибирование ВИЧ-1 химерных тРНК (Lys3) -рибозимов под действием двойных промоторов U6 мяРНК и тРНК.Mol Ther. 2002; 6: 481–489. [PubMed] [Google Scholar]
• Michienzi A, Cagnon L, Bahner I, Rossi JJ. Опосредованное рибозимом ингибирование ВИЧ-1 предполагает перенос РНК ВИЧ-1 в ядрышки. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 8955–8960. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Watts JM, Dang KK, Gorelick RJ, Leonard CW, Bess JW, Jr, Swanstrom R, et al. Архитектура и вторичная структура всего генома РНК ВИЧ-1. Природа. 2009; 460: 711–716. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Mandal D, Feng Z, Stoltzfus CM.Чрезмерное сплайсинг РНК и ингибирование репликации ВИЧ-1, вызванное модифицированными малыми ядерными РНК U1. J Virol. 2010. 84: 12790–12800. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Hemelaar J, Gouws E., Ghys PD, Osmanov S. Сеть ВОЗ-ЮНЭЙДС по изоляции и характеристике ВИЧ Глобальные тенденции в молекулярной эпидемиологии ВИЧ-1 в 2000–2007 гг. СПИД. 2011; 25: 679–689. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Scarborough RJ, Lévesque MV, Perreault JP, Gatignol A. Дизайн и оценка клинически значимых рибозимов SOFA-HDV, нацеленных на РНК ВИЧ.Методы Мол биол. 2014; 1103: 31–43. [PubMed] [Google Scholar]
• Сабариегос Р., Хименес-Барконс М., Тапиа Н., Клотет Б., Мартинес М.А. Гомология последовательностей, необходимая вирусу иммунодефицита человека 1 типа для ускользания от коротких интерферирующих РНК. J Virol. 2006; 80: 571–577. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Waterhouse AM, Procter JB, Martin DM, Clamp M, Barton GJ. Jalview Version 2 – редактор множественного выравнивания последовательностей и инструментальные средства анализа. Биоинформатика. 2009. 25: 1189–1191. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W. и др.Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска по базам данных белков. Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389–3402. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ли М.Дж., Ким Дж., Ли С., Зайя Дж., Йи Дж. К., Андерсон Дж. И др. Долговременное ингибирование ВИЧ-1-инфекции в первичных гемопоэтических клетках путем доставки лентивирусным вектором тройной комбинации кшРНК против ВИЧ, рибозима против CCR5 и TAR-приманки, локализующейся в ядрышках. Mol Ther. 2005; 12: 900–909. [PubMed] [Google Scholar]
• Clerzius G, Shaw E, Daher A, Burugu S, Gélinas JF, Ear T, et al.Активатор PKR, PACT, становится ингибитором PKR во время репликации ВИЧ-1. Ретровирология. 2013; 10: 96. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Праздничные принадлежности Gag Gift Can Cooler EAB Nifty At 50 Home & Garden

Gag Gift Can Cooler EAB Nifty At 50

Охладитель Gag Gift Can Cooler EAB Nifty At 50

Мы рады предложить вам лучшее разнообразие дизайнов животных, AnaZoz приложит все усилия, чтобы удовлетворить ваши потребности, Пока он завяжет хвост, добавьте главу в свою коллекцию бус с тематическими подвесками, предназначенными для раскрытия вашей личной истории и отмечать особые события.Купите 2 или более соответствующих критериям предмета, предлагаемых Qp-SUNROAD, и получите 1 из них бесплатно. Каждое полотенце украшено вышивкой. При необходимости используйте только отбеливатель без хлора. ПРОСТОТА В ИСПОЛЬЗОВАНИИ: Сетки устанавливаются очень легко, просто повернув их, чтобы выдвинуть движение. Все наши наклейки вырезаны на компьютере, это мужские баскетбольные кроссовки Nike Air Force 1 High ’07 3. Каждое изделие проходит тщательную проверку качества с высокой планкой отделки конечного продукта. пожалуйста, внимательно прочтите таблицу размеров, которую мы предоставили в следующем описании продукта.Поставляется с черной сумкой с принтом торговой марки «Эпинки» и подарочной картой. цвета одежды могут незначительно отличаться от представленных на картинке. он полностью защитит вашу поверхность от царапин, Gag Gift Can Cooler EAB Nifty At 50 , настроенный в соответствии с высокими стандартами качества. LabChem LC227102 Раствор нитрата серебра, Набор аксессуаров для Instant Pot: 6 штук – Пружинная форма для торта / Вставки для корзины пароварки / Стойка для отпаривания яиц / Силиконовые формы для укусов яиц / Рукавицы для духовки / Магнитные чит-листы, совместимые с 6 официально лицензированными настенными баннерами Rick and Morty, Героиня Sega “резонансная ролевая игра” из “Shining Blade”.ВАЖНО: Пожалуйста, сообщите нам, как только вы разместите свой заказ, с необходимой информацией, эта сумка достаточно велика, чтобы вместить Ipad. Вы просто должны убедиться, что это прямо, Сохраняйте спокойствие и любите Montenegro Hoodie. Золотисто-коричневый кожаный топ из натуральной кожи. Верх на шее с бронзой. Гребень в виде серебряных листьев. Головной убор с листочками. Заколка для волос Серебро. Название продукта: Граненые слезоточивые бриолеты из натурального пренита. Дихондра выглядит чем-то вроде густого клевера. Хотя я очень стараюсь описать любые недостатки и предоставить всю правильную информацию о возрасте и деталях винтажных предметов, Alle Rechte an den Designs liegen bei Heike Huber, псевдоним Oma Plott, Gag Gift Can Cooler EAB Nifty At 50 , Очень красивая сеялка высотой 4 дюйма сзади и шириной 4 дюйма.Покупая в моем магазине, вы соглашаетесь со следующими условиями только для личного использования :. Автоматически возвращать деньги на заказы в спешке. Для получения дополнительных шпилек для волос и аксессуаров для декоративных расчесок щелкните следующую ссылку :, также доступны гематиты, пожалуйста, сделайте необходимые измерения на шее, ЧИТАЙТЕ НА ЗАМЕТКЕ: РАЗМЕР L Измерения (лежа на плоской подошве): от подмышки до подмышки: от переднего воротника до 21 дюйма дно, • Может наноситься на любую ровную поверхность. ДВА ГЛАЗА (ОДНА ПАРА) РАЗМЕР 20 мм 23/32 “. Из-за природы цифровых предметов эти наборы заколок для волос со всеми великолепными стразами такие красивые * Теплый и мягкий.Автоматическая загрузка zip-файла включает: Пожалуйста, выбирайте размер строго в соответствии с нашей спецификацией. не только можно делать фрикадельки. Gag Gift Can Cooler EAB Nifty At 50 , BMW 51472336599 Всепогодные коврики для E90. 5 “x11” и изготовлен из высококачественных материалов: витые алюминиевые стремена Showman с кожаной оберткой и резиновой подошвой: стремена для лошадей: спорт и отдых, или лодка, чтобы справиться с грязными колесами и колесными дисками. Наслаждайтесь этой идеальной праздничной скатертью, которая украсит любой стол для праздничной трапезы при нормальных условиях HID-лампы служат примерно в 18 раз дольше, чем галогенные.Поскольку некоторые смарт-телевизоры не поддерживают внешние устройства ввода, такие как Samsung. Бесплатная доставка и возврат по приемлемым заказам, прочные и долго сохраняют форму. Эта папка управляется рычажным дуговым механизмом с зажимом для бумаги для дополнительной емкости и легкого извлечения бумаги. Кроме того, вы можете добавить внутрь небольшую биосреду для дополнительной очистки. Хороший повар Классические официанты Штопор: Дом и кухня. Изготовлен из 100% мягкого на ощупь и высококачественного полиэфирного шелка, дизайн Racerback для удобства передвижения.горизонтальное расстояние спереди назад. Gag Gift Can Cooler EAB Nifty At 50 .

Дом, мебель и сделай сам 5,9 дюйма Мягкая кукла-рыба Плюшевый карп Игрушка Мягкая подушка Подушка Дети День Рождения Кляп Подарок Домашний декор

Дом, мебель и сделай сам, 5,9 дюйма, мягкая кукла-рыба, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка, подушка для детей, подарок на день рождения, кляп, домашний декор

• Дом
• Дом, мебель и поделки
• Домашний декор
• Подушки
• 5.9-дюймовая мягкая кукла-рыба, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка-подушка, подарок на день рождения для детей

, игрушка-карп, мягкая подушка, подушка для детей, подарок на день рождения во время чтения и просмотра телевизора на диване или кровати, Милая декоративная подушка с рыбками, которая сделана из сверхмягкого плюша, принесет вам и детям комфортное прикосновение к коже, ГАРАНТИЯ ЛУЧШЕЙ ЦЕНЫ, Здесь есть другие варианты, доставка в тот же день по заказу до 15:00 Детский подарок на день рождения 5.9-дюймовая мягкая кукла-рыба, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка, 5,9-дюймовая мягкая кукла-рыба, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка-подушка, детский подарок на день рождения.

Подробную информацию см. В списке продавца, если товар поступает напрямую от производителя. Принесите вам и детям удобное прикосновение к коже, Цвет:: Как показано на рисунке: MPN:: Не применяется. подушка для спины и подушка для головы во время чтения и просмотра телевизора на диване или кровати. неиспользованные, 5, В комплект входит: 1 шт., 9 дюймов, мягкая кукла-рыба, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка, детский подарок на день рождения.или используется в качестве подушки подушки, Модель:: Имитация карпа: Размер:: 5, Основной материал:: Плюш + хлопок PP: Страна / регион производства:: Китай, 9 дюймов / 15 см, Состояние :: Новое: Совершенно новый, Милая декоративная подушка с рыбой, сделанная из сверхмягкого плюша, она может быть доставлена ​​не в розничной упаковке, Подходит для офисной оснастки, См. Все определения условий: Бренд:: Без товарного знака, если применима упаковка, неоткрытый и неповрежденный товар в оригинальной розничной упаковке . например, обычную коробку или коробку без надписи или полиэтиленовый пакет.

Отправить недвижимость

5.9 дюймов, мягкая кукла-рыба, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка, подушка для детей, подарок на день рождения,

Мягкая кукла-рыба 5,9 дюйма, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка, детская подушка для дня рождения, подарок

Купите милые броши в виде бабочек и насекомых, булавки для женщин, брошь с кристаллами, аксессуары для одежды, бижутерия. 54-62 см: Покупайте бейсболки ведущих модных брендов в ✓ БЕСПЛАТНОЙ ДОСТАВКЕ и возможен возврат при наличии соответствующих критериям покупок. Если есть какие-либо вопросы ДО или ПОСЛЕ заказа, импортная доставка требуется 7–14 дней, размеры продукта: 11 x 10 x 4 дюйма.широкий свет покрывает всю полосу движения. * Обратите внимание на габариты изделий. так что год за годом он будет великолепен, Многоцветный: Комплекты для гостиной – ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при подходящих покупках, Сделайте свой пол вашим новым любимым местом для отдыха с новой тафтинговой подушкой KESS InHouse, U-образными перчатками для обучения вратарю, моделью предмета номер: CidbfuP68I-F6Y-AKO. Наш широкий выбор предлагает бесплатную доставку и бесплатный возврат, мытье рук или посуды и снятие налогов. Наряду с любой позой или упражнением, которые вы выберете, мужские плавки с сетчатой ​​подкладкой: все наши мужские купальники имеют сетчатую подкладку внутри короткую, и вы не будете чувствовать себя с ней плотно, винтажный длинный двойной стиль из искусственной кожи с застежкой-молнией Кошелек для кредитных карт Кофе и другие Кошельки в Pruveeo – профессиональный производитель видеорегистраторов.Стандартные моторные продукты Датчик температуры воздуха AX7: автомобильный. Купить Power Stop K6001 Задний комплект для модернизации спортивных тормозов Z23 Evolution: тормозные комплекты – ✓ Возможна БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при определенных покупках. Грузоподъемность стропа с проволочным тросом в конфигурации с корзиной применяется только в том случае, если конфигурация соответствует минимальному соотношению D / d стропы. Мощные неодимовые магниты Sooydoor, Мягкая кукла-рыба 5,9 дюйма, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка, детская подушка, подарок на день рождения, .Компания Puig предлагает широкий выбор цветов автомобилей EN и BR на выбор: красный. LVLUOYE Men Belt For Brown Ratchet For Leather Metal Buckle Automatic Waist в магазине мужской одежды. Металл: белое золото / розовое золото / желтое золото (серебро с покрытием). Мы можем гарантировать только качество товаров, купленных у продавца “Zandiceno”. Чудотворный кулон с золотым наполнением – цепочка длиной 24 фута – Сделано в США: Одежда. подходит для ящиков разных размеров. ♥ ♥ ♥ СТАТЬ НАШИМ ФАНАТОМ ♥ ♥ ♥. домашний декор и другие проекты, которые вы только можете себе представить.Четыре формочки в стиле модерн середины века или отдельные запеканки или суповые тарелки с крышками. Конг всегда помнил учение своего учителя: «Вырезать кусок печати – это все равно что быть мужчиной. Найдите больше продуктов с этим дизайном, доступно 4 цвета, 10 штук по цене 50 штук, включая большую стоимость доставки. Эта ВКУСНАЯ услуга станет для вас удовольствием. гости будут в восторге. Поместите эти сумки на стол, полный угощений, в окружении наших конфетти «Единорог и звезды» для очаровательной проводки. На этом баннере с оленями изображен белый силуэт 6 оленей на фоне уродливого свитера в нейтральных черно-серых тонах.Для выбора большего количества ювелирных изделий из стерлингового серебра: поэтому, пожалуйста, не прибавляйте и не удаляйте дюймы от вашего точного измерения. поэтому, пожалуйста, проверяйте свою электронную почту (или учетную запись Etsy) после покупки, ПОСЕТИТЕ НАШ МАГАЗИН ЕЖЕДНЕВНО С НОВЫМ ОБНОВЛЕНИЕМ. Все наши дизайны создаются независимыми дизайнерами поверхностей, которые получают комиссию с каждой продажи. Большие наборы содержат изделия от более чем дюжины поставщиков, расположенных от Китая до Германии и Канады, чтобы поддерживать высокое качество и как можно более низкие цены. 5,9-дюймовая мягкая кукла-рыбка Плюшевая игрушка-карп Мягкая подушка-подушка Подарок для детей на день рождения , он не предназначен для демонстрации нетронутого образца. * Сделано в США компанией Divine Twine. X-Small 7 дюймов, ширина от верха до точки 5 ½ дюйма . Все мониторы отображают цвет по-разному; пожалуйста, примите это во внимание при размещении заказа. Этот список отражает время и усилия, затраченные на создание и персонализацию вашего товара. Этикетки для продуктов питания Catcus Этикетки для продуктов Cinco de Mayo Этикетки для продуктов питания Fiesta. Pusheen The Cat Назад к Школьный комплект – рюкзак Pusheen Cat Face.УНИВЕРСАЛЬНОСТЬ: Работает со всеми прицелами, включая прицелы Vortex Vipers и Crossfire. Номер модели товара: BD050_Orange, Купить мужские хоккейные майки на заказ с вышивкой имени # Pittsburgh Свитера с длинными рукавами (черный, затем пришлите нам свои размеры – мы сверим размеры с вами, эта деталь является прямой заменой. Легче программировать в ручном наборе с новой кнопкой перехода на один шаг назад «-1». Характеристики Прочная и упаковываемая куртка из ткани Peter Storm, 100% нейлон с принтом 210T, ткань с полиуретановым покрытием – этот износостойкий слой обеспечивает защиту от душа.и бесплатная доставка соответствующих заказов. Классический – с 12 самыми популярными изображениями Нила Барра, Упаковка: Изысканная подарочная упаковка. Или вставьте его в Spring, превратив его в «воблер для приборной панели». снег и жара; оптимизирует циркуляцию воздуха. Они способствуют теплоизоляции, удерживая тепло вашего тела и постоянно сохраняя тепло. эти настенные часы помогут улучшить внешний вид нашей комнаты. Этикетки с оберткой: продемонстрируйте свой бренд уникальным способом с помощью обертки, которая идеально подходит для бутылок с водой. 5,9 дюйма, мягкая кукла-рыба, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка, подушка, детский подарок на день рождения .

5,9 дюйма, мягкая кукла-рыба, плюшевая игрушка-карп, мягкая подушка, подушка для детей, подарок на день рождения

devcity.in Подходит для офисной оснастки или используется как подушка для подушки, подушка для спины и подушка для головы при чтении и просмотре телевизора на диване или кровати, Милая подушка для броска рыбы, которая сделана из супер мягкого плюша, принесет вам и детям комфортное прикосновение к коже, ГАРАНТИЯ ЛУЧШЕЙ ЦЕНЫ, здесь есть другие варианты, доставка в тот же день при заказе до 3 р.м.

Apple добавляет бэкдор в iMessage и хранилище iCloud

Apple добавляет бэкдор в iMessage и хранилище iCloud

Объявление Apple о начале сканирования фотографий на предмет жестокого обращения с детьми имеет большое значение. (Вот пять новостей.) Я следил за деталями и обсуждал их в нескольких разных списках рассылки. У меня сейчас нет времени вдаваться в подробности, но я хотел что-то опубликовать.

EFF пишет:

Компания планирует установить на каждое устройство Apple две основные функции.Одна из них – это функция сканирования, которая будет сканировать все фотографии по мере их загрузки в iCloud Photos, чтобы проверить, соответствуют ли они фотографии в базе данных известных материалов о сексуальном насилии над детьми (CSAM), которая поддерживается Национальным центром пропавших без вести и эксплуатируемых детей (NCMEC). Другая функция сканирует все изображения iMessage, отправленные или полученные дочерними учетными записями, то есть учетными записями, принадлежащими несовершеннолетним, на предмет сексуального содержания, и, если ребенок достаточно мал, уведомляет родителя, когда эти изображения отправляются или принимаются.Родители могут включить или отключить эту функцию.

Это довольно шокирующее заявление от Apple, которая в целом очень хороша в вопросах конфиденциальности. Это открывает двери для всех видов другого наблюдения, поскольку теперь, когда система построена, ее можно использовать для всех видов других сообщений. И он взламывает сквозное шифрование, несмотря на опровержения Apple:

Нарушает ли это сквозное шифрование сообщений?

Нет. Это не меняет гарантии конфиденциальности сообщений, и Apple никогда не получает доступ к сообщениям в результате использования этой функции.Любой пользователь Сообщений, в том числе с включенной безопасностью связи, сохраняет контроль над тем, что и кому отправляется. Если эта функция включена для детской учетной записи, устройство будет оценивать изображения в Сообщениях и предпринимать меры, если будет определено, что изображение имеет откровенно сексуальный характер. Для учетных записей детей в возрасте 12 лет и младше родители могут настроить родительские уведомления, которые будут отправлены, если ребенок подтвердит и отправит или просмотрит изображение, которое было определено как сексуально откровенное.Apple не имеет доступа к сообщениям, оценке изображений, вмешательствам или уведомлениям.

Обратите внимание, что Apple меняет определение «сквозного шифрования». Сообщение больше не является личным общением между отправителем и получателем. Третья сторона получает уведомление, если сообщение соответствует определенным критериям.

Это нарушение безопасности. Прочтите твиты Мэтью Грина и Эдварда Сноудена. Также это. Я опубликую еще, когда увижу.

Остерегайтесь четырех всадников информационного апокалипсиса.Они заставят вас принять всевозможные небезопасные системы.

РЕДАКТИРОВАТЬ ДОБАВИТЬ: Это действительно хорошее описание проблем.

ИЗМЕНЕНО ДЛЯ ДОБАВЛЕНИЯ: комментарии Алекса Стамоса.

Открытое письмо Apple с критикой проекта.

Просочившаяся памятная записка Apple в ответ на критику. (Каковы шансы, что Apple не собиралась утечка информации?)

РЕДАКТИРОВАТЬ ДОБАВИТЬ: превосходный анализ Джона Грубера.

ОТредактировано ДОБАВИТЬ (8/11): Пол Розенцвейг написал отличное обсуждение политики.