Механизм дивана клик-кляк книжка. Размер спального места

Диван — ключевой элемент в гостиной и зоне отдыха, в домашнем кабинете.Именно диван задает стиль и характер гостиной комнаты.

Диван — ключевой элемент в гостиной и зоне отдыха, в домашнем кабинете. Классические диваны для гостиной, представляют собой стандартные конфигурации мебели: широкая спинка, подлокотники и спокойная обивка. Модерн четкие линии, прямые формы и ровные изгибы без резких форм. Именно диван задает стиль и характер гостиной комнаты. Он прекрасно дополнит ваш интерьер, а также будет радовать ваших гостей, атмосферой комфорта и уюта.

Характеристики механизма дивана клик-кляк книжка:

Размер спального места в разложенном состоянии: 1300Х1950 мм.

Габаритные размеры (ШХДХВ): 1100Х1950Х1000 мм.

Механизм выполнен из металлических профилей сечением 30Х30 мм, толщина стенки профиля 1,5 мм. В механизме используются березовые ламели шириной 53 мм, которые крепятся к рамке с помощью накладных латодержателей.

Расстояние между ламелями 80 мм. Механизм дивана упакован в картонный короб размером: 2000Х650Х120 мм. Подлокотники продаются отдельно от механизма дивана.

Бельевой ящик с ортопедическим основанием, подъемным механизмом и газовыми амортизаторами, разнообразные модели кроватей, как с бельевым ящиком, так и с ортопедическим основанием, комплекты мебели и отдельные предметы мебели для спальни и детской комнаты, винные шкафы и тумбы,шкафы-купе, диваны, отгрузка мебели во все регионы, выбор клиентом транспортной компании, низкие цены на мебель, матрасы, наматрасники и комплектующие для мебели, поможем создать  дизайн интерьера, подобрать матрас с ортопедическими свойствами, мягкий, жёсткий или средней жёсткости матрас, стороны матраса с разной степенью жёсткости, ортопедическая решетка для кровати с опорами и без них, шкаф в кровать, подставка под матрас с ограничителями, бельевой ящик для дивана, купить мебель с доставкой по Москве, Московской области и в регионы.

Замок NSM для механизма Клик Кляк (Крашеный)

Замок для дивана Клик кляк фиксируется внутри ящика для белья. Имеет положения – сидя, полусидя и лежа. Изготовлен из стали 3 мм. Цена за комплект.

Цена1800 руб

Параметры для платежной системы для формирования чеков:

Ставка НДС:

Предмет расчета:

Способ расчета:

Цена 1800 руб

Описание товара

           Клик-кляк – это название, которое произошло от сходства со звуком, который появляется при трансформации конструкции из положения «сидя» в «лежа» и наоборот.

          В отличие от большинства других механизмов, диван «Клик-кляк» имеет 3 положения спинки: «сидя», «лежа» и «полулежа» (или, как его еще называют, «релакс»).

          Диваны с механизмом «Клик-кляк», как правило, оснащены большим вместительным бельевым коробом.  

   Одним из главных преимуществ данного механизма является его 

экономичность. Стандартные диваны «Клик-кляк» сопоставимы по цене с диванами «книжка». При этом, более просты в трансформации и имеют более надежный стальной каркас. Диван «Клик-кляк» – комфортен. Имеет высокую спинку, поэтому на нем удобно сидеть, а в положении лежа образует полноценное спальное место, пригодного для ежедневного сна.

        В основе металлического основания «Клик-кляка» устанавливаются березовые ламели. При выборе качественного матраса спальное место приобретает отличный ортопедический эффект.

        Однако, нужно учитывать, что при трансформации дивана в положение лежа спинке необходимо определенное место, т.е.  данную модель не получится вплотную пододвинуть к стенке.  

      

Замок NSM – это связующий механизм двух частей каркаса дивана: спинки и сидения. Именно благодаря ему происходит изменение положения спинки. В отличии от оригинального замка, NSM обладает усиленной конструкцией из стали толщиной 3 мм.

         ОКРАШЕННЫЙ замок позволяет избежать мелкой металлической стружки в бельевом коробе, которая может появиться при трении деталей НЕокрашенного замка.  

Раскладной механизм дивана клик-кляк, модельный ряд “Рокки”

Раскладной механизм дивана клик-кляк, модельный ряд “Рокки”

В диванах-кроватях  клик-кляк «Рокки» имеются подлокотники, которые фиксируются в разных положениях. Для их трансформации в металлическую раму вваривается храповой механизм (трещётка). Благодаря этому каждый подлокотник можно устанавливать как в горизонтальном положении, так и в почти вертикальном. В диванах клик-кляк «Рокки» растровые подлокотники ставятся и в раму спинки дивана и в сидение. Каждый из 4 подлокотников трансформируется и фиксируется независимо от других.

  

  

трансформация механизма клик-кляк Рокки

диван-кровать клик-кляк “Рокки”		кресло-кровать клик-кляк “Рокки”

 

• размеры спального место дивана – кровати клик-кляк “Рокки” 2000мм * 1400мм
• размеры спального место крела – кровати клик-кляк “Рокки” 1300мм *  1300мм

 

Порядок действий при раскладке  дивана «Рокки» из положения “диван” в положение “кровать”:

1. Приподнять раму сидения, при этом спинку положить горизонтально. Если при положенной горизонтально спинке раму сидения отжать вперед почти до вертикального положения, в механизме раздастся щелчок. После этого щелчка сиденье и спинка укладывается в горизонтальное положение.
2. Для трансформации “кровать” – наклонное положение сиденье дивана приподнять до первого щелчка. И до второго щелчка, если требуется сложить в положение “диван”. Сиденье опустить, при этом спинка дивана в зависимости от количества щелчков примет выбранное положение

 

Стандартный каркас

:

8 ортопедических лат шириной 53 мм каждая

Допустимая нагрузка на поднятый подлокотник – до 40 кг

Каждодневный (усиленный) каркас:

8 ортопедических лат шириной 85 мм каждая

Допустимая нагрузка на поднятый подлокотник – до 70 кг

И в каждодневном (усиленном) каркасах, и в стандартном  нагрузка на подлокотник в горизонтальном положении без ограничения.

Длина дивана меняется под заказ от 1750 мм  до 2050 мм (полностью разложенные).

Физиология, рвотный рефлекс, статья

Введение

Рвотный рефлекс, также известный как глоточный рефлекс, представляет собой рефлекторное сокращение мышц задней части глотки после стимуляции задней стенки глотки, области миндалин или основания языка. Считается, что рвотный рефлекс – это эволюционный рефлекс, который развился как метод предотвращения всасывания твердых частиц пищи. Это важный компонент оценки мозгового ствола мозга и играет роль в объявлении смерти мозга.[1]

Механизм

Рвотный рефлекс контролируют как языкоглоточный (IX), так и блуждающий (X) нервы, которые служат афферентной и эфферентной конечностями для рефлекторной дуги, соответственно. Нервные корешки черепных нервов IX и X выходят из продолговатого мозга через яремное отверстие и спускаются по обе стороны глотки, чтобы окончательно иннервировать заднюю часть глотки, заднюю треть языка, мягкое небо и шилоглоточную мышцу. [2]

Стимул обеспечивается ощущением задней стенки глотки, миндалин или основания языка. Эти ощущения передаются через CN IX, которая действует как афферентная ветвь рефлекса к ипсилатеральному солитарному ядру (также называемому вкусовым ядром) после синапса с верхним ганглием, расположенным в яремном отверстии. В свою очередь, эти ядра отправляют волокна к неоднозначному ядру, которое является двигательным ядром, находящимся в ростральном мозговом слое. Эфферентные нервные волокна к мускулатуре глотки проходят от ядра ambiguus через CN X.В конечном итоге это приводит к двустороннему сокращению задних мышц глотки.

Сокращение мускулатуры глотки на ипсилатеральной стороне стимула известно как прямой рвотный рефлекс, а сокращение мускулатуры на противоположной стороне известно как согласованный рвотный рефлекс.

Проверка рвотного рефлекса также может помочь оценить повреждение CN IX и CN X. Если языкоглоточный нерв (IX) поврежден с одной стороны, реакции на прикосновение не будет. Если блуждающий (X) нерв поврежден, и при прикосновении к любой его стороне, мягкое небо поднимется и переместится в сторону пораженной стороны. Если и CN IX, и X повреждены с одной стороны, прикосновение к неповрежденной стороне приведет к одностороннему ответу с отклонением неба в эту сторону. При прикосновении к поврежденной стороне реакции не будет.

Стимуляция мягкого неба также может вызвать рвотный рефлекс; однако сенсорной конечностью в данном случае является тройничный нерв (CN V). Здесь сенсорная стимуляция мягкого неба проходит через ядра спинномозгового тракта тройничного нерва.

Сопутствующие испытания

Оборудование: Рвотный рефлекс можно вызвать с помощью язычка или аппликатора из мягкой ваты. У интубированного пациента всасывающее устройство может быть наиболее удобным для тестирования.

Техника: Обследующий стимулирует заднюю часть глотки с помощью лезвия для языка или ватного аппликатора.

После этого у пациента будет развиваться рвотная реакция, которая может привести к рвоте у некоторых пациентов.Кроме того, необходимо обследовать подъем двусторонних задних мышц глотки. В исследовании с участием 104 студентов-медиков, оценивающих рвотный рефлекс, исследователи заметили, что стимуляция задней части глотки с большей вероятностью вызывает рвотный рефлекс, чем стимуляция задней части языка [3].

Асимметричный ответ или отсутствие ответа при стимуляции одной стороны указывает на наличие патологии и требует дальнейшей оценки.

• Альтернативы: Мягкий небный рефлекс может помочь оценить функцию CN IX и X, поскольку этот рефлекс может быть неизменным при отсутствии рвотного рефлекса.Голос оценивается на предмет охриплости и дисфонии для определения патологии ХНХ. Исследования также показали, что кашлевой рефлекс лучше воспроизводится у интубированных пациентов, чем рвотный рефлекс при проверке функции ствола мозга [4].

• Использование возможностей медицинской бригады: Поскольку существует множество методов, используемых для оценки рвотного рефлекса, существует плохое согласие между наблюдателями. Следовательно, оправдан стандартный метод обследования пациентов для конкретных определенных клинических сценариев.Однако рвотный рефлекс остается обязательным при оценке функции ствола мозга, особенно в условиях смерти мозга.

Противопоказания:

Во время оценки проходимости дыхательных путей для интубации у пациента с обструкцией рвотный рефлекс не следует проводить из-за риска рвоты и последующей аспирации. [5]

У пациентов с гиперчувствительным рвотным рефлексом может быть сложно оценить состояние полости рта. Этим пациентам может быть полезна внутривенная седация во время протезирования.[6]

Клиническая значимость

Рвотный рефлекс когда-то служил методом выявления дисфагии при остром инсульте. В одном исследовании, сравнивающем рвотный рефлекс с оценкой глотания у постели больного у 242 пациентов, исследователи обнаружили, что отсутствие рвотного рефлекса было специфичным и соответствовало неспособности глотания, оцениваемой у постели больного, но не чувствительной у пациентов с инсультом. Исследование показало, что специфичность рвотного рефлекса при выявлении дисфагии составляла 96%, а чувствительность – 39%.Тем не менее, неповрежденный рвотный рефлекс указывает на наличие защиты от долгосрочных проблем с глотанием и предсказывает снижение потребности в энтеральном питании в будущем. [7]

исследование показало, что задние мышцы глотки, контролирующие рвотный рефлекс, не зависят от мышц, отвечающих за глотание. Следовательно, врачи не должны полагаться на отсутствие рвотного рефлекса в качестве предиктора аспирации у пациентов с инсультом. Непрямая ларингоскопия оказалась лучшей альтернативой проведению рвотного рефлекса для оценки безопасности дыхательных путей.Исследователи также отметили, что каждый третий человек может не иметь рвотного рефлекса из-за привыкания или испытывать влияние эмоций через высшие центры. Ощущение глотки, напротив, редко отсутствует и, таким образом, используется как альтернатива тестированию рвотного рефлекса и может лучше помочь в прогнозировании будущих проблем с глотанием. [3] [7] [8]

Перед интубацией пациента необходима глубокая седация, чтобы подтвердить отсутствие рвотного рефлекса, в отличие от случаев, когда пациенты получают только минимальную и умеренную седацию, когда наличие рвотного рефлекса должно быть подтверждено для защиты дыхательных путей. .\ [Vb6FчaƖ | 8 / с (ho конечный поток эндобдж 32 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 16 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 48 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 52 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 12 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО. ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 1 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 4 0 obj >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 30 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.\ [Vb6FчaƖ | 8 / с (ho конечный поток эндобдж 24 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 38 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 26 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 5 0 obj >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 119 >> поток xA0DQ \ j’jAJ`i73ɼӑ- ܛ, * 78L ~ kG۰ ^ \ [Vb6FчaƖ | 8 / с (ho конечный поток эндобдж 49 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 119 >> поток xA0DQ \ j’jAJ`i73ɼӑ- ܛ, * 78L ~ kG۰ ^ \ [Vb6FчaƖ | 8 / с (ho конечный поток эндобдж 47 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 119 >> поток xA0DQ \ j’jAJ`i73ɼӑ- ܛ, * 78L ~ kG۰ ^ \ [Vb6FчaƖ | 8 / с (ho конечный поток эндобдж 18 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО. \ [Vb6FчaƖ | 8 / с (ho конечный поток эндобдж 44 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 22 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 42 0 объект >>> / BBox [0 0 531 657] / Длина 124 >> поток xA 0EslN3 muWDR4oQ-xB / hwО.ǝqYVFҴws أ bI # ̦fO \ qLU O ݒ 5 # / конечный поток эндобдж 59 0 объект > поток x +

Молекулярная инженерия химии гликозаминогликанов для доставки биомолекул

Abstract

Гликозаминогликаны (ГАГ) – это линейные, отрицательно заряженные полисахариды, которые взаимодействуют с различными положительно заряженными факторами роста.В этой обзорной статье представлены эффекты инженерной химии GAG для приложений молекулярной доставки в регенеративной медицине. Обсуждаются три основные области взаимодействия структура-функция-свойство: 1) макромолекулярные свойства ГАГ, 2) влияние химических модификаций на связывание белков и 3) механизмы деградации ГАГ. Взаимодействия ГАГ-белок могут быть основаны на 1) характере сульфатирования ГАГ, 2) углеводной конформации ГАГ и 3) поведении полиэлектролита ГАГ. Химические модификации ГАГ, которые обычно выполняются для создания молекулярных систем доставки, влияют на связывание с белками и сильно зависят от сайта модификации на молекулах ГАГ.Скорость и способ разложения могут определять высвобождение молекул, а также длину фрагментов ГАГ, с которыми груз электростатически связан и в конечном итоге высвобождается из системы доставки. В целом, полимеры на основе ГАГ представляют собой универсальную платформу для биоматериалов, предлагающую новые средства для создания молекулярных систем доставки с высокой степенью контроля, чтобы лучше лечить ряд дегенерированных или поврежденных тканей.

3 ВВЕДЕНИЕ

Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой класс линейных полисахаридов, которые повсеместно встречаются в организме человека и обладают множеством биологических функций, необходимых для жизни [1]. Такие функции состоят из 1) осмотического притяжения воды и, следовательно, поддержания гидростатического давления для придания механической стабильности соединительным тканям, таким как хрящ [2–6], 2) ковалентного присоединения к протеогликанам, которые регулируют функцию клеток [7], и 3) совместного действия. с белками на поверхности клеток через рецепторы или корецепторы для модуляции локальной биологической среды [8]. Основываясь на их многочисленных биологических функциях, ГАГ широко исследовались в качестве биоматериалов для контролируемой доставки белка с целью улучшения лечения различных заболеваний [9–12].

Многие из их биологических функций обеспечиваются уникальной химической структурой ГАГ, состоящей из повторяющихся дисахаридных единиц, специфичных для каждого вида ГАГ. Сульфатированные формы GAG, такие как хондроитинсульфат (CS), гепарин, гепарансульфат (HS), дерматансульфат (DS) и кератансульфат (KS), несут отрицательные заряды, которые различаются по плотности и положению в дисахаридных единицах [13]. Помимо сульфатированных ГАГ, гиалуроновая кислота (НА) не сульфатирована и, следовательно, является ГАГ с наименьшим суммарным отрицательным зарядом [14].Основываясь на этом отрицательном суммарном заряде, GAGs привлекают положительно заряженные белки, однако эти процессы связывания очень сложно исследовать, поскольку они регулируются сложными внутренними химическими свойствами GAGs [15-17]. Для приложений доставки белка был разработан ряд подходов на основе GAG, которые имитируют взаимодействия, которые происходят в природе между GAG в ECM и партнерами по связыванию фактора роста. ГАГ могут обладать специфическими, специфичными для углеводной последовательности, электростатическими сайтами связывания для некоторых факторов роста, или они могут связывать факторы роста посредством электростатического механизма, не специфичного для последовательности [18].

Хотя белковые сайты связывания, включая конформационные изменения при связывании, были рассмотрены ранее [19–21], эта работа сосредоточена на обзоре химических свойств и модификаций GAGs для связывания белков и включения в сложные системы доставки биомолекул. Помимо рассмотрения эффектов на связывание с белками, химические модификации влияют на процессы деградации [22, 23], которые, в свою очередь, влияют на характеристики высвобождения молекул, и поэтому механизмы деградации также подробно обсуждаются здесь.Тщательное понимание химических свойств ГАГ, как нативных, так и модифицированных, и того, как они связаны со связыванием с белками, является ключевым фактором для успешной реализации стратегий использования биоматериалов на основе ГАГ в тканевой инженерии и приложениях для доставки лекарств. Как описано в этом обзоре, лучшее понимание химии ГАГ приведет к повышению предсказуемости поглощения и высвобождения белка из биоматериалов на основе ГАГ и, таким образом, к способности разрабатывать более эффективные стратегии использования уникальных, врожденных свойств ГАГ для широкого диапазона применения регенеративной медицины.

4 СВЯЗЬ ГАГ-БЕЛКОВ: ФУНКЦИЯ СИСТЕМЫ СУЛЬФАЦИИ, ТРЕХМЕРНАЯ КОНФОРМАЦИЯ И СВОЙСТВА ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТА

Обычно считается, что суммарный отрицательный заряд в первую очередь отвечает за опосредование взаимодействий ГАГ с противоположно заряженными белками, но образование полиэлектролитного комплекса не полностью объясняет белок близость к ГАГам. Первичная структура ГАГ определяется повторяющимися углеводными единицами с их специфическими паттернами сульфатирования, которые влияют на сложные трехмерные структуры, которые вносят вклад в фармакологическую активность ГАГ.Более того, большинство видов GAG не существуют in vivo в изолированном состоянии, а вместо этого синтезируются в форме протеогликанов (PG) или служат корецепторами путем образования комплекса GAG-фактор роста на поверхности клеток [24]. . Присоединение GAG к PG напрямую связано не с паттерном сульфатирования, а со специфической последовательностью концевой углеводной группы, с помощью которой цепи GAG связаны с коровым белком PG. Присоединение GAG-PG уже было рассмотрено [7, 25] и, таким образом, этот раздел фокусируется на важности 3D-структуры GAG в сочетании с паттерном сульфатирования для связывания факторов роста для каждого основного представителя семейства GAG.

4.1 Углеводные структуры и номенклатура

Для справки читателя в этом разделе обобщены наиболее важные структуры моносахаридов, конформации и конфигурации субъединиц GAG, чтобы лучше понять конкретные эпитопы, представленные в следующих разделах. Рекомендации по правилам номенклатуры сахаров и определению конформации опубликованы Международным союзом теоретической и прикладной химии (IUPAC) [26, 27]. Важными для ГАГ моносахаридными единицами являются уроновая кислота и аминосахара ().Такие моносахариды могут приобретать различные конформации раствора (). Среди наиболее известных моделей – кресло ( C ), лодка ( B ) и конверт ( E ). Конформации кресла и промежуточные конформации между креслом и лодкой, косая лодка ( S ), играет важную роль в связывании антитромбина III (AT III) с гепарином (). В растворе каждый углевод находится в равновесии со своими различными формами. Кроме того, номенклатура α / β- и D, L также используется для различения различных конфигураций ().

Наиболее известные моносахариды, присутствующие в ГАГ. Сахара уроновой кислоты обладают карбоксильной функцией, связанной с C5 кольцевого атома, тогда как аминосахара имеют аминогруппу в положении C2. Эта аминогруппа может существовать в виде свободного амина (редко), ацетилированного (показано выше) или сульфатированного (см. ) В полисахаридах GAG.

(A.) Углеводные конформации показаны в виде кресла ( C ) и косой лодки ( S ). В конформациях кресла серые воображаемые плоскости соединяют кольцевые атомы углерода на параллельных участках.Кольцевые атомы углерода, находящиеся вне плоскости, определяют конформации. В этой номенклатуре углерод над плоскостью отмечен надстрочным индексом C , а углерод под ним становится подстрочным индексом. Для конформации косой лодки серая плоскость соединяет атомы углерода 1,3,4,5. Углероды над этой плоскостью обозначаются надстрочными индексами, а атомы углерода ниже – подстрочными. Поскольку в этой конформации под плоскостью нет атомов углерода, нижний индекс – O. (B.) Стереохимия углеводов и конфигурация D, L с глюкуроновой кислотой в качестве примера.Номенклатура α / β описывает конфигурацию стереоцентров в C1 и C5, в то время как номенклатура D, L связана с положением заместителя в проекции Фишера (здесь не будет дополнительно объяснено – см. Подробности в [26]).

4.2 Структура гепарина и гепарансульфата

Углеводный состав гепарина и гепарансульфата (HS) аналогичен, но отличается соотношением моносахаридов и распределением структуры сульфатирования. Наиболее заметная повторяющаяся единица дисахарида в гепарине состоит из 2-O сульфатированной L-идуроновой кислоты (IduA2S, α-1,4) и смеси N- и 6-O сульфатированных (GlcNS6S) или N-ацетилированных D-глюкозамина ( GlcNAc, α-1,4).В HS вместо IduA2S гепарина большинство остатков уроновой кислоты представляют собой D-глюкуроновую кислоту (GlcA, β-1,4). Эти повторяющиеся единицы связаны в сложную структуру, включая другие остатки с дополнительными O- и N-сульфатированными группами: GlcNAc может быть дополнительно 6-O сульфатирован (GlcNAc6S) или GlcNS, реже 3-O сульфатирован (GlcNS3.6S) [28] . Нефракционированный гепарин имеет молярную массу от 3 до 30 кДа (в среднем 15 кДа) [29], тогда как гепарансульфат, например из печени человека, как было установлено, имеет молярную массу около 24 кДа [30]. Гепарансульфат является ключевым компонентом PG, секретируемых во внеклеточный матрикс, таких как перлекан [31] или агрин [32], но трансмембранные PG HS также могут служить рецепторами или корецепторами (например, синдеканами) [33]. Следовательно, HS присутствует во многих тканях и может выполнять множество функций, в то время как присутствие гепарина у человека ограничено очень немногими тканями. Наиболее подробно гепарин встречается в гранулах тучных клеток, где его функция и эволюционная роль до сих пор полностью не изучены [34, 35].

Помимо распределения и функции тканей, между HS и гепарином существуют общие структурные различия. В частности, эти разновидности различаются по общему распределению заряда вдоль полимерной цепи: гепарансульфат демонстрирует богатые сульфатом или «S-богатые» области [36], которые разделены дисахаридными единицами, которые содержат в основном несульфатированный, ацетилированный глюкозамин и GlcA (NA -области [37]). Интересно, что количество кластеров сульфата HS изменяется во время дифференцировки клеток, приводя к более сульфатированным областям с большей дифференцировкой, тогда как стволовые клетки обнаруживают меньшее количество кластеров сульфата [38, 39]. Комбинация сульфатированных и несульфатированных областей в HS приводит к очень гибкой конформационной структуре, поскольку чередующаяся структура, состоящая из областей с высоким и низким уровнем сульфатирования, может заставлять HS связываться и «оборачиваться» вокруг множества белков посредством неуглеводной последовательности. специфические взаимодействия [40, 41]. Хотя взаимодействия HS-белок не всегда могут быть последовательными, разные типы клеток продуцируют производные HS с различными повторяющимися моделями моносахаридов в сульфатированных областях, которые потенциально объясняют некоторую специфичность белка в определенных тканях, но точную физиологическую роль тканезависимых композиций HS остается неизвестным [42].

В отличие от взаимодействий, не связанных с последовательностью, взаимодействия GAG-белок, специфичные для углеводной последовательности, были выяснены для гепарина / HS. Наиболее хорошо изученным примером является связывание основного фактора роста фибробластов (FGF-2) с гепарином / HS, специфичность и эффекты которого изучаются с 1980-х годов [43]. Семейство FGF состоит из 22 различных изоформ, которые подразделяются на 7 подсемейств [44]. Трансмембранный рецептор тирозинкиназы для FGF активируется гепарином или HS в качестве кофактора, который индуцирует димеризацию FGF и усиливает передачу сигналов FGF [45].В серии исследований по этой теме было обнаружено, что минимальная пентасахаридная последовательность [46] из гепарина ответственна за спаривание FGF-2. Более того, считалось, что 6-O десульфатированный (остаток глюкозамина) гепарин способствует связыванию FGF-2, и было обнаружено, что 2-O сульфатные группы (остаток идуроновой кислоты) необходимы для взаимодействия. Было обнаружено, что помимо притяжения FGF-2, 2-O-сульфатирование идуроновой кислоты является важным для связывания с белками, такими как нейротропный фактор глиальных клеток человека [47] и эндостатин [48].Однако в других исследованиях декасахаридная единица, полностью N-сульфатированная и частично сульфатированная 2-O- (остаток IduA) и 6-O- (остаток GlcNS), была определена как минимальный связывающий мотив для FGF-1 и FGF- 4 [49]. Кроме того, было обнаружено, что карбоксильная функция остатков уроновой кислоты () необходима для связывания с FGF-2.

Результаты, описанные выше, подчеркивают несоответствия в минимальной длине связывающей последовательности и паттернах сульфатирования, которые, как считается, необходимы для связывания FGF [50–53].Чтобы объяснить различные результаты для суперсемейства FGF, необходимо учитывать один важный момент – это гетерогенность семейства белков FGF, а также конформационные изменения самого полисахарида. Конформационные аспекты в настоящее время исследуются с использованием молекулярного моделирования [54] и аналитических инструментов, таких как ЯМР-спектроскопия [55, 56]. Обычно пиранозные сахара (6-членная кольцевая система, состоящая из 5 кольцевых атомов углерода и 1 кислорода), такие как идуроновая кислота, присутствуют одновременно в разных конформациях: конформации кресла ( ⁴ C ₁ , ¹ C ₄ ) или косой лодочкой ( ² S _O ) (). Эти конформации находятся в равновесии друг с другом, когда сахара находятся в растворе, а гликозидные связи предоставляют небольшую степень свободы для переключения между конформациями [57]. В этом контексте важна роль 2-O-сульфатирования (IduA) для связывания антитромбина III AT-III в целях антикоагуляции, так как 2-O-сульфатирование (IduA), а также 3-O-сульфатирование ( GlcNS3.6S) вызывают конформационное изменение конформации косой лодки при связывании гепарина с AT-III [58]. После связывания с AT-III гепарин усиливает антикоагулянтную активность AT-III на фактор 2000 [59].Однако область связывания AT-III [57, 58, 60, 61] находится за пределами активной области связывания для FGF (FGF-1/2) [62], поэтому относительный вклад конформации GAG во взаимодействие с FGF остается неизвестным. . Конформации углеводов и активности сульфатных групп, которые имеют отношение к связыванию белков, суммированы в.

Конформация углеводов в гепарине и гепарансуфате: (A) пентасахаридная последовательность гепарина для AT-III, (B. ) важные сайты связывания факторов роста с последовательностью образца трисахарида гепарин / HS.Положение сульфатных групп обозначается их биологической активностью. Синие прямоугольники указывают на необходимость присутствия для связывания с белками.

В целом гепарин и HS демонстрируют структурное сходство, но различаются в основном распределением и количеством сульфатных групп на полимерную цепь. Структура сульфатного кластера HS допускает множество взаимодействий с белками, не относящимися к углеводной последовательности, тогда как гепарин обладает определенной последовательностью связывания углеводов AT-III. Более того, тот факт, что полиэлектролитная природа только ГАГ может приводить к «случайному» связыванию, основанному исключительно на электростатических взаимодействиях, хорошо охарактеризована для HS [18, 41] и, вероятно, может быть предположена также и для гепарина.

4.3 Структура хондроитинсульфата и дерматансульфата

Хондроитинсульфат (CS) и дерматансульфат (DS) структурно родственны и часто встречаются вместе в PG. Моносахаридными компонентами наиболее заметных повторяющихся дисахаридных единиц в хондроитинсульфате (CS) являются D-глюкуроновая кислота (GlcA, β-1,4) и N-ацетил-D-галактозамин (GalNAc, β-1,3) [63] . Эпимеризация по C-5 () во время DS-биосинтеза некоторых остатков D-глюкуроновой кислоты в L-идуроновую кислоту (IduA) превращает CS в DS, что осуществляется in vivo с помощью специфических эпимераз [64, 65].Как правило, остатки IduA можно найти только рядом с GalNAc-4-сульфатом (GalNAc4S) [66]. Хотя молярные массы CS и DS схожи (23 кДа [67] и 25 кДа [68], соответственно), паттерны сульфатирования обоих GAG очень разнообразны, и была установлена ​​отдельная номенклатура для разных видов CS. Обычно полимеры CS обозначаются как CS-A (GalNAc4S), CS-C (GalNAc6S), CS-D (GlcA2S, GalNAc6S) и CS-E (GalNAc4,6S) в зависимости от комбинации положений сульфата. Для DS наиболее частым паттерном сульфатирования является GalNAc4S, связанный с IduA [69].Функции сульфатных групп для CS и DS суммированы в.

Структуры CS (A.) и DS (B.). Синие прямоугольники указывают на необходимость связывания с белками.

Взаимодействие факторов роста с CS и DS происходит в PG-связанном состоянии, поскольку ни CS, ни DS не доступны в свободном состоянии в крови или ткани. PG часто содержат смеси CS и DS, специфичные для ткани, в которой они были синтезированы. ПГ, богатые CS, такие как версикан (соединительные ткани) и аггрекан (хрящ), и богатые DS PG, такие как декорин и бигликан (оба обнаруживаются в соединительных тканях) [70, 71], являются важными кофакторами для функции рецепторов [72].

Для DS остаток IduA, аналогичный гепарину и гепарансульфату, может существовать в нескольких конформациях, включая ⁴ C ₁ , ¹ C ₄ и ² S _O [63]. В гепарине, помимо углеводных конформаций, упомянутых в предыдущем подразделе, важна конкретная углеводная последовательность пентасахарида для связывания с AT-III и ингибирования тромбина () [58]. Хотя он не содержит этой специфической углеводной последовательности, DS оказался альтернативным антикоагулянтом [73, 74], антикоагулянтные свойства которого связаны с содержанием IduA2S.В отличие от обычных DS, высокосульфатированные производные DS с высоким уровнем IduA2S, как было обнаружено, связывают кофактор гепарина II менее специфическим образом, чем DS с более низким уровнем сульфатирования [75], а в тестах агрегации тромбоцитов было обнаружено, что они также связываются с AT-III. [76]. Для этой цели продается 4,6-дисульфатированный DS [77], однако, с другим механизмом действия по сравнению с гепарином. Эффекты антикоагуляции гепарина в основном обусловлены специфическим взаимодействием с AT-III, тогда как DS активирует кофактор гепарина II, который затем ингибирует тромбин [78, 79].Аналогично, для химически гиперсульфатированного CS [80] изменение остатка GlcA с конформации ⁴ C ₁ на ¹ C ₄ имитирует стереохимию 2-O сульфатированного IduA гепарина. (часть специфической связывающей последовательности AT-III), что делает гиперсульфатированный CS более активным в отношении кофактора гепарина II с аналогичным потенциалом по сравнению с DS.

Углеводная последовательность и специфичность сульфатирования фактора роста по отношению к CS и DS была тщательно исследована, и, особенно для нейротропных факторов роста, имеются убедительные доказательства специфичности углеводной последовательности, которая запускает белковые взаимодействия и усиливает регенерацию нейронов [81].Однако для многих других факторов роста четкая специфичность углеводной последовательности не всегда сообщается, и поэтому возможно чисто электростатическое взаимодействие между факторами роста и CS / DS.

CS и DS привлекли большое внимание как компоненты PGs, которые могут влиять на рост нервов и дифференцировку нервных стволовых клеток [82, 83]. Было обнаружено, что в зависимости от презентации эпитопа C4,6S он либо ингибирует (как часть миметика PG) [84], либо способствует (как часть тетрасахарида) [81] разрастанию нейронов. Факторы роста нейронов, такие как мидкин и нейротропный фактор головного мозга, связываются с высоким сродством с C4,6S, и было высказано предположение, что мотивы распознавания C4,6S присутствуют в рецепторах или корецепторах в нервной среде для таких факторов роста [85 ]. Помимо воздействия на регенерацию нервов и рубцевание, CS также может взаимодействовать с факторами роста в других тканях. Группа 6-O сульфата считается важной для связывания TGFβ1 [86], который важен для образования хрящевой ткани.В другом исследовании [87] CS и сульфатированный HA сравнивали друг с другом с точки зрения аффинности связывания с костным морфогенетическим белком 4 (BMP-4), который имеет множество мишеней при регенерации костной и хрящевой ткани [88, 89]. CS и HA имеют одну углеводную единицу, GlcA, и C4S сравнивали с HA, который был сульфатирован в положении 6-O (HA) GalNAc. Было обнаружено, что C4S имеет более низкое сродство к BMP-4 по сравнению с 6-O сульфатированной HA, и было высказано предположение, что, помимо других конформационных различий, 6-O сульфат в GalNAc способствует связыванию BMP-4. Однако было обнаружено, что двойной паттерн 4,6-сульфатирования на CS важен для связывания BMP-4, чтобы стимулировать дифференцировку и минерализацию остеобластов [90], что позволяет предположить, что C4,6S может быть сильным промотором фактора роста. активность вне нейрональной среды.

Было обнаружено, что для растворимых DS-PG, секретируемых в раны, взаимодействие с FGF-2 после травмы оказывает огромное положительное влияние на заживление ран [91]. Когда смешанные полимеры CS / DS были выделены из протеогликанового декорина, был предложен трисульфатированный пентасахаридный связывающий мотив FGF-2 в CS / DS, содержащий два потенциальных образца сульфатирования: 2-O-сульфатированный IduA с 4,6-дисульфатированным GalNAc или 2-O-сульфатированный IduA и GlcA в сочетании с 4-O сульфатированным GalNAc [92].В других исследованиях была обнаружена последовательность связывания октасахарида для FGF-2 и последовательность декасахарида для FGF-7, и было обнаружено, что 4-O сульфатирование GalNAc и присутствие IduA были важны для эффективного связывания [93]. Кроме того, декасахаридная последовательность, содержащая IduA, была выяснена как минимальный связывающий мотив для FGF-10 [94]. Приведенные выше примеры указывают на важность специфических олигосахаридных связывающих углеводов последовательностей, которые часто демонстрируют высокую активность с паттерном 4,6-сульфатирования для CS и 4-O-сульфатирования для DS.Также кажется, что эпимеризация на C-5 с образованием IduA из GlcA, наиболее важное структурное различие между CS и DS, изменяет селективность фактора роста и сродство между CS и DS.

CS и DS – это тесно связанные GAG, обнаруженные в широком диапазоне PG. В отличие от обычного неспецифического связывания HS со многими белками, существуют убедительные доказательства того, что 4,6-сульфатный эпитоп CS усиливает связывание фактора роста и передачу сигналов. Было обнаружено, что это играет важную роль в центральной нервной системе, регулируя рост нейритов [84].В дополнение к модели сульфатирования, углеводная конформация является ключевым аспектом DS как для взаимодействия факторов роста, так и для усиления антикоагулянтной активности.

4.4 Структура кератансульфата

Кератансульфат (KS) в основном состоит из повторяющихся единиц D-галактозы (Gal, β-1,3) и N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), которые встречаются во многих комбинациях в полимерной цепи [95 ]. Было обнаружено, что оба моносахарида содержат сульфатную группу в положении 6-O [96]. KS является важным компонентом PG (например.грамм. agrecan), где он прикреплен к CS и DS. Разработана специфическая номенклатура различных типов KS на основе типа присоединения к коровому белку PG, относящаяся к KS как к типу I (N-связанный с остатком Asn в PG), II (O-связанный с остатками Ser / Thr в PG). PG) или III (манноза, связанная с остатком Ser в PG) [97]. Типичные молярные массы KS колеблются от 7 до 22 кДа [98], а PG KS присутствуют в больших количествах, особенно в роговице [99], с более низкими концентрациями в хрящах (например, в аггрекане) [100] и многих других тканях, таких как мозг [101] и межпозвоночный диск [102].

Характер сульфатирования моносахаридов неравномерно распределен по цепям KS, что приводит к областям высокого и низкого сульфатирования [103]. Как правило, несульфатированные области придают конформационную гибкость, которая может приводить к образованию спиральной структуры в растворе, как определено данными дифракции рентгеновских лучей [104], что делает его конформационно похожим на CS и DS.

Относительно мало известно о влиянии характера сульфатирования KS на связывание со специфическими белками.Было показано, что паттерн сульфатирования KS важен для аффинности связывания с белками galectin [105], классом в основном внутриклеточных белков, обладающих мотивом связывания углеводов, который может секретироваться в ECM и регулировать клеточную адгезию [106]. При исследовании три- и пентасахаридов KS с различными типами сульфатирования было обнаружено, что несульфатированная 6-ОН группа остатка Gal важна для связывания галектина, тогда как 6-О-сульфатирование остатка GlcNAc не увеличивает связывание галектинов [105] ( ).Кроме того, десульфатированные KS-полисахариды (содержащие галактозу) проявляли связывание с галектинами, тогда как сульфатированные виды не проявляли каких-либо обнаруживаемых эффектов, что позволяет предположить, что для этого специфического класса белков 6-O-сульфатирование остатков Gal ингибирует связывание и что взаимодействия галектинов с GAG в первую очередь опосредовано гидрофобными и / или ван-дер-ваальсовыми силами вместо электростатических взаимодействий [105].

Первичная последовательность кератансульфата: 6-O сульфат D-галактозамин и 6-O сульфат N-ацетилглюкозамин.Синий прямоугольник указывает на необходимость связывания фактора роста, тогда как красный прямоугольник указывает на уменьшение связывания галектина.

KS обнаруживается совместно с CS и DS в PG, но эффект связывания белка с одиночными полимерными цепями KS внутри PG не был в центре внимания текущих исследований, и поэтому знания по этой теме остаются ограниченными. Однако то, что известно о связывании KS-белка (с галектинами), демонстрирует, что несульфатированный остаток Gal необходим для связывания неэлектростатическим путем.Такое поведение контрастирует с тем, что известно о гепарине / HS и CS / DS, где сульфатирование в первую очередь определяет сродство к факторам роста, и предполагает, что стратегии связывания с белками, возможно, потребуется адаптировать на основе класса GAG, который будет включен в доставку лекарства. транспортное средство.

4.5 Структура гиалуронана

Гиалуронан (НА) является необычным членом семейства ГАГ по сравнению с вышеупомянутыми видами, поскольку это единственный несульфатированный вид. Полимеры HA состоят из дисахаридных единиц D-GlcA (β-1,4) и D-GlcNAc (β-1,3) и в естественных условиях встречаются со степенью полимеризации в диапазоне от 2000 до 25000 дисахаридных единиц (1-10 МДа) [107 ] ().Размер сборок HA может дополнительно увеличиваться за счет агрегации, которая происходит в тканях, таких как хрящ, где HA образует тройной комплекс с аггреканом и связывающим белком [108]. ГК может быть обнаружен в каждой соединительной ткани и в высоких концентрациях в стекловидном теле глаза [109]. Можно предположить, что конформация углеводов в полимере находится в конформации ⁴ C ₁ , которая стабилизируется внутримолекулярно за счет сильной водородной связи между углеводами [110].Эта водородная связь находится в быстром обмене с молекулами воды, что является одним из объяснений удивительно высокой способности связывать воду, даже несмотря на то, что ГК несульфатирована и, следовательно, имеет уменьшенное электростатическое взаимодействие с водой [109].

Дисахаридные единицы НА: D-глюкуроновая кислота и D-N-ацетилглюкозамин.

HA, как известно, действует внутриклеточно (например, внутриклеточный Rhamm-белок) [111] и внеклеточно, где он служит в качестве молекулы прямого мессенджера, связываясь с рецептором CD-44 на клеточной поверхности [112].Помимо CD-44, HA, как известно, взаимодействует с другими рецепторами клеточной поверхности, такими как внеклеточный Rhamm [113] и ICAM-1 [114]. Ожидаемый способ взаимодействия и связывания с белками / рецепторами основан на взаимодействиях карбоксиламиногрупп. Взаимодействие основных аминокислот CD-44 с HA выявлено путем скремблирования аминокислотных последовательностей растворимого CD-44 [115]. Однако в довольно недавнем исследовании была обнаружена последовательность связывания октасахарида HA с CD-44, где взаимодействия между обоими видами в основном регулируются водородными связями и менее выражены электростатическими взаимодействиями [116].

HA может индуцировать передачу сигналов через внеклеточные рецепторы (например, CD-44, Rhamm), а также через связывание с внутриклеточными белками для регулирования клеточных функций. Это резко контрастирует с другими ГАГ, которые действуют через связывание фактора роста, индуцируя передачу сигнала. Однако стимулирование связывания фактора роста с ГК может быть достигнуто путем химического сульфатирования полимера (дальнейшее обсуждение методов сульфатирования см. В разделе 5.1).

4.6 Парадигма биологической активности при связывании фактора роста

Несмотря на широко распространенное мнение о том, что связывание ГАГ-фактор роста обеспечивает значительную биологическую активность, существуют сценарии, которые могут бросить вызов этой парадигме: 1) изменения в характере сульфатирования ГАГ могут привести к к связыванию факторов роста, но полученный комплекс ГАГ-фактор роста имеет ослабленную биологическую активность, и 2) модифицированные ГАГ, необходимые в качестве сигнальных кофакторов, не связываются только с факторами роста или рецепторами-мишенями, но фактор роста, тем не менее, приводит к активации клеточного поверхностных рецепторов, образуя комплекс фактора роста – ГАГ.

Хороший пример первого сценария был продемонстрирован с селективно десульфатированным гепарином и FGF-2 [117]. Передача сигналов обычно достигается за счет образования тройного комплекса FGF-2, рецептора FGF FGFR-1 и гепарина / HS. Было исследовано связывание FGF-2 с 2-O и 6-O-десульфатированным гепарином, и последующая передача сигналов через рецептор FGFR-1 отслеживалась посредством пролиферации HS-дефицитных клеток яичника китайского хомячка (CHO677). Сульфатирование 2-O необходимо для связывания гепарина с FGF-2, тогда как мотивы сульфатирования 2-O и 6-O необходимы для связывания и активации рецептора.Комплекс 6-O десульфатированного гепарина FGF-2 связывался со своим рецептором со значительно меньшим сродством по сравнению с немодифицированным гепарином, тем самым предотвращая передачу сигналов рецептора, измеренную по активности киназы Erk2 и синтезу ДНК в клетках CHO677. Более того, в соревновательном эксперименте стимулирующий эффект немодифицированного гепарина можно было полностью устранить, добавив избыток 6-O десульфатированного гепарина.

Последний сценарий, при котором ГАГ не связываются ни с фактором роста, ни с рецептором, может быть проиллюстрирован исследованием связывания HS и FGF-1 / FGFR-1 [118].Результаты свидетельствуют о том, что 6-O или 3-O сульфатированные и N-сульфатированные HS не связываются ни с FGFR-1, ни с FGF-1 по отдельности, но 6-O или 3-O, N-сульфатированные формы HS способны индуцировать тройной комплекс. это привело к ожидаемой митогенной активности на экспрессирующих FGFR1 клетках BaF3. Важно отметить, что N-ацетилированный HS, который не несет N-сульфатную группу, независимо от его характера O-сульфатирования, не был способен связываться с фактором роста или рецептором или индуцировать тройной комплекс, таким образом, только тройная комбинация GAG, фактор роста и рецептор привели к передаче сигналов внутри клеток.Этот результат подтвердил необходимость N-сульфатных групп индуцировать передачу сигналов через комплекс FGF-1 / FGFR-1. В случае FGF-1 эти результаты также указывают на то, что исследование связывания GAG-фактора роста или связывания GAG-рецептора не может быть предсказуемым для образования требуемых тройных комплексов, которые, как известно, индуцируют передачу сигналов и биологическую активность в клетках.

ГАГ, как было обнаружено, связываются с факторами роста электростатически, специфичным для углеводной последовательности или неспецифичным для последовательности образом.Примеры, обсужденные выше, бросают вызов общепринятой парадигме, согласно которой связывание GAG-фактора роста обязательно приводит к передаче сигналов в клетках-мишенях. Следовательно, существует очевидная потребность в измерении активности факторов роста с помощью соответствующих биологических (обычно клеточных) анализов после включения факторов роста и ГАГ в системы доставки лекарств, особенно при работе с химически модифицированными ГАГ, как обсуждается в следующем разделе.

5 СТРУКТУРНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ГАГОВ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ В СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Перед использованием электростатических взаимодействий между положительно заряженными факторами роста и ГАГ для достижения желаемой кинетики высвобождения для конкретного биомедицинского применения, ГАГ необходимо включить в системы доставки лекарств. которые могут быть эффективно развернуты in vitro или in vivo .Такие методы включения часто состоят из сшивания GAG в матрицу определенного типа, что требует предварительных химических модификаций GAG. Однако, как обсуждалось в предыдущем разделе, специфичные для углеводной последовательности и неспецифические для последовательности взаимодействия факторов роста с ГАГ частично основаны на характере сульфатирования и конформации раствора полисахаридов. Таким образом, в этом разделе обобщены общие химические модификации ГАГ, которые связаны с их потенциальным воздействием на связывание и высвобождение белков.

5.1 Регулировка схем сульфатирования

Было предпринято несколько попыток химически модулировать свойства сульфатирования ГАГ посредством 1) селективной десульфатирования природных ГАГ или 2) полной десульфатирования с селективным ресульфатированием. Большинство процедур селективной десульфатирования были разработаны для гепарина и включают либо сольволитические процессы, либо специфическую этерификацию с последующим сольволизом. Прямой сольволиз может производить селективный N-десульфатированный гепарин [119], селективный десульфатированный 6-O [120] и полностью десульфатированный гепарин [121].В зависимости от типа смеси растворителей, используемой для сольволиза, разложение полисахаридов может происходить [122] и более выражено для хондроитинсульфата, чем для гепарина [123], но точные причины такой разницы в восприимчивости к расщеплению основной цепи остаются неизвестными. Получение 2-O и 3-O десульфатированного гепарина также получали щелочной лиофилизацией, которая сопровождается деполимеризацией, аналогичной процессам в вышеупомянутых смесях растворителей [28, 124].

Противоположный путь реакции, повторное сульфатирование с предварительным десульфатированием или без него, был установлен для всех видов ГАГ для получения либо сверхсульфатированных ГАГ (реакция без предварительного десульфатирования), либо специфически сульфатированных ГАГ (полное десульфатирование с повторным сульфированием).Полная десульфатация может быть достигнута простой кислотной обработкой метанолом в течение нескольких дней, что было первоначально описано для хондроитинсульфата [125]. После десульфатирования введение комплексов триоксида серы приводит к повторному сульфатированию, а также может использоваться для избыточного сульфатирования частично сульфатированных ГАГ [126, 127]. Используя этот метод сверхсульфатирования, для искусственно сульфатированных полимеров ГК (sHA) была обнаружена корреляция между повышенной степенью сульфатирования sHA и большим связыванием TGFβ1 и BMP-4 [86, 87].По-видимому, конформация цепи полимера НА благоприятна для взаимодействия с некоторыми факторами роста, поскольку при сравнении sHA с CS с аналогичной степенью сульфатирования sHA связывает более высокие количества TGFβ1 [86]. Для гепарина была описана технология O-селективного ресульфатирования, зависящая от температуры [128]. С помощью любого метода реакции могут быть достигнуты O-селективные схемы сульфатирования, при этом схемы сульфатирования равномерно распределены по полимерной цепи (без кластеризации). Одно из различий между HS и гепарином заключается в конформационной гибкости, достигаемой за счет кластерной структуры сульфата HS, которая может приводить к усиленным электростатическим взаимодействиям с белками. Однако имитация доменной структуры S- / NA, обнаруженная в HS, в настоящее время технически невозможна с помощью вышеупомянутых методов, поскольку получение кластеров сульфатирования не может быть достигнуто с помощью относительно неспецифических реакций в растворе. Если будет сочтено необходимым, вариантом для имитации этого поведения может быть применение реакций раскрытия углеводного кольца на гепарин (обсуждается в разделе 5.3), что может привести к локальной потере жесткой кольцевой структуры гепарина.

5.2 Модификации функциональных групп

Большинство опубликованных отчетов сосредоточены на модификациях ГАГ в их функциональных группах, таких как 1) аминогруппы неацетилированных, неаминсульфатированных аминосахаров, 2) карбоксильные функции остатков уроновой кислоты. и 3) гидроксильные группы.Функционализация по аминогруппам незамещенного GlcN, особенно для гепарина, в котором количество свободных несульфатированных аминогрупп довольно низко, изучалась редко, потому что стадия N-десульфатирования должна быть проведена перед дальнейшей модификацией, что не является прямым подход к приготовлению систем доставки лекарств. Однако в некоторых отчетах основное внимание уделяется приготовлению селективно N-десульфатированного гепарина [119, 129], который может быть использован для механистических исследований белковых взаимодействий и молекулярной доставки, поскольку N-десульфатированный гепарин / HS теряет большую часть своей антикоагулянтной активности (3 –5 раз меньше обычного гепарина) [130].Сообщалось также о сшивании N-десульфатированного гепарина глутаровым альдегидом с образованием высокомолекулярных полимеров или гидрогелей [131].

Модификации карбоксильной функции происходят в остатках уроновой кислоты, где химия карбодиимида [132], которая способна связывать первичные аминогруппы с карбоксильными группами с разумным выходом и воспроизводимостью, широко используется для материалов на основе ГАГ. Коллагеновые матрицы, покрытые гепарином, для нанесения на культуру клеток получали путем сшивания карбоксильных групп гепарина с первичными аминами коллагена [133, 134].Более того, эта химия была использована для функционализации ГАГ метакриламидом [135, 136], цистеамином для последующего тиолирования [137, 138] или азидсодержащими соединениями для реакций циклоприсоединения Хьюисгена [139, 140]. Эти функционализированные материалы затем могут быть сшиты посредством радикальной полимеризации или циклоприсоединения с образованием систем доставки лекарственного средства в виде частиц или гидрогеля.

Модификации гидроксильных групп также менее распространены, но реакция CS с глицидилметакрилатом может давать смесь карбоксильных и гидроксил-модифицированных ГАГ [141–143].Связывание этого реагента с ГАГ может быть полезным путем для увеличения плотности сшивания за счет увеличения числа потенциальных реактивных сайтов, что может быть необходимо в случае низких выходов реакции из-за модификаций карбоксильных групп или когда для сшивания требуется высокая степень модификации.

Расположение модификаций ГАГ для включения системы доставки может изменять связывание белка по сравнению с большинством опубликованной литературы, в которой основное внимание уделяется ГАГ в растворе [41, 58, 144, 145].В одном исследовании с использованием различных методов прививки для модификации гепарина производными биотина посредством 1) химии EDC / NHS по карбоксильной функции, 2) связывания с редкими незамещенными внутрицепочечными аминами и 3) раскрытия углеводного цикла на восстанавливающем конце [146], связывание с 4 белками было проверено. Для всех белков связывание с гепарином, модифицированным на редуцирующем конце, было выше по сравнению с двумя другими методами. Наименьшее связывание было обнаружено для гепарина с модифицированной карбоксильной функцией. Сходным образом снижение связывания с модификацией карбоксильной функции ранее сообщалось между карбоксиметилированным гепарином и AT-III [147] и карбоксиметилированным, сульфатированным HA и TGFβ1 [86].Также было обнаружено уменьшение взаимодействия bFGF с увеличением степени функционализации гепаринакрилата в растворе [148].

5.3 Модификации с раскрытием углеводного кольца

Вышеупомянутые результаты ясно показывают, что модификация GAG, особенно по карбоксильной группе, и иммобилизация в системах доставки лекарств могут значительно влиять на связывающую способность белка и последующее высвобождение. Поэтому необходимы альтернативные химические составы, которые обеспечивают аналогичную универсальную применимость по сравнению с химией EDC / NHS, но с меньшим влиянием на важную карбоксильную функцию.

Одним из альтернативных вариантов химии является раскрытие углеводного кольца ГАГ, которое может происходить в естественных условиях на конце восстанавливающего конца полимерной цепи, поскольку восстановительные сахара находятся в равновесии со своими альдегидными формами в растворе. Это равновесие между открытыми и закрытыми углеводными кольцами можно использовать для мечения красителями или поверхностной прививки на восстанавливающем конце. Общая процедура модификации на восстанавливающем конце включает реакцию с первичным амином с образованием основания Шиффа с последующим восстановлением до вторичного амина [149].Подобная реакция для мечения гепарансульфата сульфо-NHS-биотином может быть использована для трансплантации ГАГ на покрытые стрептавидином поверхности. Однако недостатком реакции с восстанавливающим концом является то, что, поскольку существует только один восстанавливающий конец на цепь, такие реакции с концевыми группами будут приводить только к одному реакционноспособному центру на полимере. Низкое количество реактивных положений может быть проблематичным для формирования большинства систем доставки лекарств, поскольку плотность сшивания для ГАГ будет довольно низкой, что может привести к неполному включению.

Однако применение химии раскрытия кольца для создания множества сайтов связывания может быть выполнено для некоторых ГАГ путем окисления периодатом (см. Пример в). Окисление периодатом открывает углеводное кольцо между двумя вицинальными гидроксильными группами, в результате чего образуются два альдегида и, в зависимости от количества вицинальных гидроксильных групп, высвобождается муравьиная кислота [150]. Полученные альдегидные группы затем могут быть дополнительно модифицированы путем связывания с аминами или гидразонами с образованием основания Шиффа или гидразина соответственно.Затем основание Шиффа может быть дополнительно восстановлено с образованием стабильного вторичного амина. Такая стратегия раскрытия углеводного кольца была использована для связывания цистеамина и синтеза тиолированного гепарина, который мог образовывать наногели через дисульфидные связи [151]. Кроме того, были достигнуты реакции периодата для CS, HA и сульфата декстрана с последующим связыванием альдегидных групп с этилендиамином [152], и полученная свободная аминогруппа затем использовалась для сочетания флуоресцентных красителей для мечения GAG в нескольких положениях в пределах углеводные цепи.По аналогичной схеме реакции альдегид-ГК был синтезирован периодированием и сшит с N-сукцинилхитозаном в различных соотношениях [153]. Напротив, в другом исследовании готовили предварительно сшитые гидрогели ГК и обрабатывали периодатом, чтобы позволить дальнейшую модификацию альдегидными группами [154], что позволило присоединить RGD-содержащий пептид к поверхности матрикса через добавленные фрагменты.

Схема реакции, представляющая концепцию раскрытия углеводного цикла окислением периодатом.(Примечание: окисление периодатом происходит по несульфатированным остаткам IduA или GlcA.) В примере приводится первичный амин, который должен быть связан на второй стадии с образованием основания Шиффа. Наконец, основание Шиффа восстанавливается до вторичного амина.

Структурные модификации ГАГ, имеющие отношение к системам доставки лекарств, в основном сосредоточены на регулировании степени сульфатирования и эффективной функционализации для сшивания ГАГ в системы доставки. Доступно несколько химических методов для регулирования степени сульфатирования ГАГ путем десульфатирования или повторного сульфатирования / избыточного сульфирования существующих биополимеров с определенной селективностью по O в углеводных структурах.Сродство к положительно заряженным факторам роста можно получить, настроив степень сульфатирования. Перед сшивкой ГАГ с самими собой или другими биоматериалами часто требуется функционализация. Карбоксильные модификации популярны из-за простоты используемого химического состава, но было показано, что они влияют на связывание с белками, снижая сродство к GAG. В качестве альтернативы доступны реакции раскрытия углеводного кольца, но они требуют более тщательного исследования в отношении любого потенциального вмешательства в связывание белков, ферментов или рецепторов.

7 Резюме, выводы и перспективы на будущее

Чтобы использовать полезные эффекты ГАГ в тканевой инженерии, их часто включают в системы доставки лекарств. Однако включение GAG часто требует химических модификаций полимеров, которые могут изменять врожденные свойства GAG, которые влияют на сродство к белкам и, следовательно, изменяют ответы клеток и тканей. Таким образом, как показано в этом обзоре, более подробное знание того, как химия нативных и модифицированных ГАГ влияет на связывание и высвобождение белков, позволит улучшить разработку биоматериалов на основе ГАГ для контролируемой доставки белка.

В общем, связывание GAG-белка основано на 1) свойствах полиэлектролита, 2) характере сульфатирования и 3) конформациях углеводов. Хотя было много попыток выяснить специфические связывающие последовательности для различных GAG-связывающих белков, в некоторых случаях взаимодействия можно объяснить только электростатическими взаимодействиями, специфичными для неуглеводной последовательности, между противоположно заряженными макромолекулами. Известно, что определенные биохимические процессы (например, антикоагуляция, передача сигналов FGF-2) протекают только с очень специфическими связывающими последовательностями и конформациями углеводов (например,грамм. гепарин – AT-III, гепарин / HS – FGF-2). Однако такая высокая углеводная специфичность и специфичность структуры сульфатирования не требуется во всех случаях для связывания фактора роста. Определенные химические процессы модификации (например, реакции раскрытия углеводного кольца) позволяют в меньшей степени влиять на конформацию раствора ГАГ и, следовательно, могут представлять относительно «нативный» сайт связывания белка. Однако необходимо провести более глубокий экспериментальный анализ, прежде чем можно будет сделать выводы о «предпочтительных» и «неблагоприятных» модификациях GAG.

Что касается систем доставки лекарств, для сульфатированных ГАГ электростатические взаимодействия с молекулами груза, независимо от того, состоят ли они из небольших молекул, пептидов или белков, являются наиболее заметным механизмом, который в настоящее время управляет загрузкой и высвобождением. Высвобождение комплексов ГАГ-груз в большинстве случаев предполагается на основании данных о биоактивности выпущенного груза и указывает на то, что ГАГ могут быть полезны для стабилизации груза и усиления сигнализации.

Текущие проблемы с использованием ГАГ в системах доставки лекарств связаны с тремя основными проблемами: 1) понимание соотношения между последовательностями и последовательностями.связывание белка, не связанное с последовательностью, в сочетании с высвобождением и деградацией настройки, 2) определение применимости химии модификации к настройкам in vivo и , и 3) метаболизм и выведение модифицированных ГАГ. Что касается вопроса 1), специфичность углеводной последовательности в отношении сродства к белку может быть изменена, когда ГАГ подвергаются химическим модификациям. В случае чисто электростатических взаимодействий между ГАГ и белками, не связанных с последовательностью, только модель сульфатирования учитывает сродство, и, следовательно, взаимодействия ГАГ-белок менее чувствительны к химическому составу конкретных модификаций.В сценарии смешанного взаимодействия, когда взаимодействия, основанные на последовательностях и не на основе последовательностей, происходят одновременно (например, белок предпочитает определенное положение сульфатной группы), химические модификации ГАГ могут легко привести к значительному снижению или даже полной потере сродства к белку.

В любом сценарии тип и количество взаимодействия ГАГ-белок будет определять нагрузочную способность основанной на ГАГ системы доставки лекарств. Знание сродства и нагрузочной способности очень важно, потому что по обоим параметрам для любого заданного сценария in vitro, или in vivo можно оценить вероятность того, что загруженный груз будет высвобожден, а экзогенные белки из окружающей среды будут изолированы. вместе с грузом, или экзогенные белки будут способствовать высвобождению груза из-за конкуренции за сродство к GAG.Следовательно, в конкретной биологической среде система доставки ГАГ может привести к взрывному высвобождению (истощение груза) или очень неполному высвобождению (дальнейшее связывание, очень высокое сродство груза), в зависимости от относительного сродства различных локальных биомолекул к носителю ГАГ. Таким образом, конкретные знания о загрузке и сродстве груза потребуются при разработке и оценке систем доставки на основе GAG для конкретных сред in vitro, или in vivo, .

Инженерные подходы очень полезны для дальнейшего усовершенствования химических модификаций с целью улучшения применимости in vivo (вопросы 2 и 3 выше).В частности, если происходит сшивание в системах доставки in-situ , катализаторы и другие побочные продукты процессов полимеризации могут вызывать опасения по поводу токсичности, поэтому могут потребоваться дополнительные модификации этих реакций. Кроме того, важным компонентом является поддержание способности in vivo к разложению . В будущем необходимы дальнейшие исследования макромолекулярных свойств ГАГ, чтобы выяснить, могут ли продукты разложения на основе ГАГ систем доставки лекарств, которые были химически модифицированы до инкапсуляции, метаболизироваться и выводиться из живых организмов аналогично их немодифицированным аналоги.

На сегодняшний день материалы на основе ГАГ доказали свою безопасность и эффективность для доставки различных молекул, от факторов роста до низкомолекулярных лекарств, о чем свидетельствует их включение в медицинские устройства, одобренные для клинического использования (например, стенты, покрытые гепарином [188]). . Однако более точный контроль доставки биомолекул, который может потребоваться для регенерации тканей в будущем, требует все более сложных модификаций молекул ГАГ для дальнейшей настройки аффинности и высвобождения.Благодаря дополнительным исследованиям, позволяющим выяснить, как контролировать связывание и деградацию грузов, системы доставки на основе ГАГ имеют все возможности стать идеальной системой-носителем для контролируемого высвобождения терапевтических средств для широкого спектра применений в регенеративной медицине из-за их биоразлагаемости, нетоксичности и универсальности. для разных грузов.

Границы | Взаимодействие гликозаминогликанов с белками и их роль в заболеваниях человека

Введение

Недавно заболевание COVID-19, вызванное тяжелым острым респираторным синдромом, связанным с коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), привело к медицинским и экономическим потрясениям во всем мире.Отчеты показали, что гепарансульфат (HS) является незаменимым кофактором для инфекции SARS-CoV-2, взаимодействуя как с гликопротеином SARS-CoV-2, так и с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2) в рецептор-связывающем домене (RBD) ( Clausen et al., 2020; Kim et al., 2020). Фактические данные показали, что гепарин и его производные могут способствовать борьбе с инфекцией SARS-CoV-2 и побочными эффектами (Liu et al., 2020; Tandon et al., 2020), воздействуя на взаимодействие между HS и родственными белками.Эти исследования подчеркнули важность взаимодействий между гликозаминогликанами (ГАГ) и белками при заболевании и их роль в качестве новых терапевтических мишеней; эти взаимодействия изучались десятилетиями, но все еще отстают от изучения взаимодействий белок-белок и белок-нуклеиновая кислота из-за к структурной сложности GAG и ограничениям аналитических инструментов.

ГАГ представляют собой семейство линейных и отрицательно заряженных полисахаридов, которые обычно экспрессируются во внутренней и окружающей среде большинства типов клеток, с молекулярной массой примерно 10–100 кДа (Kowitsch et al., 2018). Среди встречающихся в природе полисахаридов структура ГАГ чрезвычайно сложна из-за изменений типов остатков, типов гликозидных связей, уровней сульфатирования, положений сульфатирования и длины цепи. В зависимости от типа гексозамина, гексозы или гексуроновой кислоты в повторяющихся единицах дисахарида и гликозидной связи между этими единицами ГАГ делятся на пять основных типов: несульфатированные ГАГ, такие как гиалуроновая кислота (ГК) (Dymarska et al., 2016) и сульфатированные ГАГ, включая гепарин и HS (Shriver et al., 2012), хондроитинсульфат (CS) (Purushothaman et al., 2012), дерматансульфат (DS) (Yamada and Sugahara, 2008) и кератансульфат (KS) (Pomin, 2015). Гепарин (~ 2,3 сульфатных группы на дисахарид) и HS (~ 0,8 сульфатных групп на дисахарид) состоят из основных дисахаридных повторов (GlcA / IdoA β 1-4GlcNAc α 1-4) _n , а 3- и Положения 6 остатка глюкозамина или карбоксильной группы уроновой кислоты могут быть замещены или не замещены сульфатными группами.Гепарин и HS привлекли наибольшее внимание и были тщательно изучены из-за их высокого сульфатирования и разнообразной биологической активности, что также является нашей первоочередной задачей в данном документе. За исключением HA, все GAG млекопитающих связаны с коровым белком с образованием протеогликанов (PG). Структура белковых ядер, состав цепей гликозаминогликанов и распределение протеогликанов влияют на биологическую активность протеогликанов (Lindahl et al., 2015).

ГАГ имеют жизненно важное значение в области гликобиологии, особенно их многочисленные роли в качестве сигнальных молекул, которые регулируют активность белка и действуют как структурные компоненты и эффекторы клеточной активности.Было продемонстрировано, что ГАГ модулируют множество биологических процессов, начиная от эмбрионального развития, регуляции ферментативной активности, сборки внеклеточного матрикса и связывания лиганда с рецепторами до регуляции клеточной передачи сигналов посредством регуляции различных белков, таких как факторы роста, хемокины и т. Д. и молекулы адгезии (Vallet et al., 2021). Эти процессы особенно важны, когда они связаны с заболеваниями, включая сердечно-сосудистые заболевания (Wight, 2018), рак (Ma et al., 2020), инфекционные заболевания (Kamhi et al., 2013), нейродегенеративные заболевания (Huynh et al., 2019), воспалительные реакции (Morla, 2019) и заживление ран (Salbach et al., 2012). Схематическое изображение структуры ГАГ и их взаимодействия с белками и функциями, относящимися к конкретным заболеваниям, показано на рисунке 1.

РИСУНОК 1 . Схематическое изображение структуры ГАГ и их взаимодействия с белками и функциями, относящимися к конкретным заболеваниям.

Связывание между ГАГ и белками носит явно ионный характер. Неионные силы, включая водородные связи и гидрофобное взаимодействие, иногда также играют важную роль в формировании комплексов GAG-белок (Capila and Linhardt, 2002). До недавнего времени было спорным, что связывание между ГАГ и белками неспецифично, поскольку все больше и больше исследований показывают относительно высокую селективность последовательности ГАГ для специфического связывания с определенными белками. Положение связывания и специфичность были продемонстрированы на рисунке 2 на примере комплекса фактор роста фибробластов (FGF) – рецептор FGF (FGFR) – гепарин (Schlessinger et al., 2000). Более того, передача сигналов FGF1 и FGF2 через FGFR 1c продемонстрировала четко различающуюся специфичность при скрининге против библиотеки химиоферментативно синтезированных HS с определенными структурами (Schultz et al., 2017). Дополнительные примеры специфичности взаимодействий GAG-белок включают 2- O -сульфат-GlcA, содержащий гексасахарид HS, селективно активирующий кофактор гепарина II (Sankarayanarayanan et al., 2017), 3- O -сульфатированный HS, который предпочтительно распознается Спайковый гликопротеин SARS-CoV-2 (Tiwari et al., 2020), и 3- O -сульфатированный октасахарид HS, специфически связывающийся с гликопротеином D вируса простого герпеса 1 типа (Huang et al., 2017). Кроме того, высокопроизводительное исследование с использованием HS-микроматрицы показало, что HS-связывающие белки, включая FGF2 и несколько хемокинов, требуют явно разных лигандов на HS (Zong et al., 2017). Обзор, посвященный теме селективности взаимодействий ГАГ-белок, был недавно написан Кьелленом и Линдалом (Kjellen and Lindahl, 2018). Избирательность этих взаимодействий является фундаментальной для создания миметиков HS в качестве многообещающих терапевтических средств.

РИСУНОК 2 . Пространственная структура комплекса FGF-FGFR-гепарин. (A) Вид поверхности. (B) Вид ленточной конструкции. Фрагменты гепарина (ΔUA-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S), которые контактируют с двумя FGF2 (показаны зеленым и оранжевым) и двумя FGFR1 (показаны фиолетовым и красным), представлены в виде шариков и палочек. Указаны аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии. Рисунок был подготовлен с использованием кода PDB 1FQ9, о котором первоначально сообщалось в ссылке Schlessinger et al.(2000).

Возрастает интерес к изучению основ взаимодействий GAG-белок и их роли в заболеваниях человека. В частности, новые терапевтические средства, направленные на специфические взаимодействия GAG-белок, имеют важное прикладное значение, такое как лечение коронарной пневмонии. Поскольку взаимодействие между ГАГ и белками включает широкий спектр физиологических процессов, влияние их взаимодействия на конкретные заболевания и их потенциальные терапевтические эффекты привлекли большое внимание в попытках найти новые методы лечения или профилактики заболеваний.Чтобы синтезировать структурные аналоги, удалить или изменить структуры или заблокировать взаимодействие с реагентами, необходимо получить определенные механизмы и связывающие последовательности. Недавние прорывы в аналитических инструментах и ​​подходах, особенно основанные на масс-спектрометрии (МС) методы секвенирования GAG и характеристики связывающих мотивов, способствовали лучшему пониманию структурной основы и механизмов взаимодействий GAG-белок, создавая возможность использовать структурное разнообразие ГАГов, чтобы открыть новые методы лечения.Дальнейшее понимание процесса и механизма взаимодействия между ГАГ и белками будет способствовать правильному пониманию возникновения и развития большого числа заболеваний и разработке новых терапевтических подходов.

Этот обзор посвящен взаимодействию между ГАГ и белками и их влиянию на болезни человека. Кроме того, представлены молекулярные основы и механизмы взаимодействия ГАГ-белок. Также обсуждаются последние достижения в области GAG-связывающих белков и аналитических инструментов.Кроме того, представлены перспективы разработки новых терапевтических средств, направленных на специфические взаимодействия GAG-белок.

Заболевания человека, связанные с взаимодействиями ГАГ-белок

Сердечно-сосудистые заболевания

Первым описанным специфическим взаимодействием ГАГ-белок был гепарин и антитромбин, который имеет важное физиологическое значение и использовался в производстве фармацевтических препаратов гепарина в качестве антикоагулянтов для лечения тромбозов. , эмболия и тромбофлебит.Гепарин и низкомолекулярный гепарин (НМГ) ингибируют факторы свертывания крови Ха и IIA, комбинируясь с антитромбином III для предотвращения тромбоза. С тех пор функция ГАГ и их взаимодействие с белками сосудистой системы изучаются. Хотя гепарин успешно используется для предотвращения тромбоза у госпитализированных пациентов, сообщалось, что в профилактических дозах он представляет риск кровотечения (Sunseri et al., 2018). Эта протромботическая побочная реакция, называемая гепарин-индуцированной тромбоцитопенией (ГИТ), опосредуется иммунитетом, а также вызвана взаимодействием между гепарином и белком.Продукты гепарина образуют многомолекулярные комплексы с антигенным фактором тромбоцитов 4 (PF4), что приводит к образованию активирующих тромбоциты антител IgG, которые противостоят комплексу гепарин / PF4, который запускает иммунный ответ и вызывает активацию и агрегацию тромбоцитов (Ho and Siordia, 2016 ). Этот процесс приводит к уменьшению количества тромбоцитов и образованию тромбина, что в конечном итоге приводит к тромбоцитопении. В то же время процесс также может сопровождаться формированием венозного или артериального тромбоза, который затем перерастает в тромбоз глубоких вен и тромбоэмболию легочной артерии (Warkentin, 2018).

Ранние исследования показали, что ГАГ накапливаются в подверженных заболеваниям участках сосудистой системы, например, в точках ветвления, и часто соответствуют отложению липидов. Последующие исследования показали, что ГАГ ковалентно связаны со специфическими коровыми белками и взаимодействуют с различными лигандами внутри интерстициального пространства, помогая регулировать структуру и функцию сосудов. PG также взаимодействуют с множеством рецепторов на поверхности сосудистых клеток, частично регулируя фенотип сосудистых клеток (Wight, 2018).Например, DSPG может способствовать формированию атеросклероза (Edwards et al., 2004), тогда как CSPG может участвовать в процессе утолщения интимы при раннем атеросклерозе (Wight and Merrilees, 2004). HSPG негативно регулируется атерогенными молекулами; таким образом, липопротеиновая регуляция эндотелина может играть ключевую роль в формировании атеросклероза (Pillarisetti, 2000). Недавно связь между сердечно-сосудистыми заболеваниями и гепарин-связывающим белком (HBP) была подтверждена с помощью методов биоинформатики (Cai et al., 2020), которые показали, что HBP могут действовать как новый биомаркер, связывающий сердечно-сосудистые заболевания, такие как атеросклероз, миокардит, ишемия миокарда и инфаркт миокарда (ИМ). Специфические HBP или сигнальные пути могут быть разработаны как новые методы лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Опухоли

В последние несколько десятилетий было обнаружено, что PG участвуют в функциях и механизмах раковых клеток и играют ключевую роль в адгезии, миграции, инвазии и метастазировании раковых клеток.Протеогликаны HS (HSPG) – это белки, ковалентно связанные с HS. Основные HSPG можно разделить на две основные категории: HSPG на клеточной поверхности (синдеканы и глипиканы) и HSPG базальной мембраны (перлекан, агрин и коллаген типа XVIII). Уровень HSPG понижен или повышен в различных опухолях (De Pasquale and Pavone, 2020). Было обнаружено, что GPC1, HSPG на клеточной поверхности, сверхэкспрессируется при раке груди (Matsuda et al., 2001), глиоме (Saito et al., 2017) и раке поджелудочной железы (Kleeff et al., 1998), но подавляется при колоректальном раке (Knelson et al., 2014). HS может связывать факторы роста для регулирования ангиогенеза, включая факторы роста фибробластов (FGF), факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и факторы роста тромбоцитов (PDGF). Perlecan на поверхности опухолевых клеток может взаимодействовать с лигандом и адапторными белками для усиления передачи сигналов FGF и ангиогенеза опухоли (Whitelock and Iozzo, 2005). Если C-конец перлекана отсутствует, синтез VEGF будет снижен, чтобы подавить ангиогенез опухоли (Sharma et al., 1998). Другие ГАГ также выполняют важные функции в опухолях. CS-E не экспрессируется в нормальных яичниках или цистаденомах, но высоко экспрессируется во внеклеточных матрицах (ECM) аденокарцином яичников, опосредуя связывание VEGF (Ten Dam et al., 2007). Сообщалось, что микросреда опухоли может индуцировать продукцию HA (Tammi et al., 2011). HA высоко экспрессируется при раке груди (Auvinen et al., 2000), раке легких (Pirinen et al., 2001) и раке яичников (Anttila et al., 2000), тогда как экспрессия HA низкая при плоскоклеточном раке и меланоме ( Karjalainen et al., 2000; Косунен и др., 2004). На основании этих исследований аномальные уровни экспрессии PG или структурные изменения PG во время онкогенеза и прогрессирования указывают на их важность в качестве потенциальных биомаркеров возникновения и прогрессирования рака и в качестве терапевтических мишеней.

Инфекционное заболевание

Учитывая их повсеместное распространение и многочисленные биологические функции, ГАГ являются основной мишенью патогенов в процессе инфекции и играют важную роль в начальном прикреплении патогенов к клеткам-хозяевам.Исследования показали, что ГАГ взаимодействуют с микробными патогенами на поверхности клеток и ECM, чтобы модулировать микробный патогенез и защиту хозяина. Многие патогенные микроорганизмы, такие как вирусы (например, вирус папилломы человека (HPV) (Kines et al., 2009), вирус гепатита C (HCV) (Barth et al., 2003), вирус денге (Dalrymple and Mackow, 2011), бактерии (например, Listeria monocytogenes (Banerjee et al., 2004) и простейшие (например, спорозоиты малярии (Clausen et al., 2012)) могут экспрессировать белки, которые связываются с HS, DS и CS на поверхности клеток, тем самым облегчая процесс инфицирования клетки-хозяина.

Последние данные показывают, что HS, как кофактор инфекции SARS-CoV-2, трансформирует структуру остистого отростка в открытую конформацию посредством взаимодействия шипового гликопротеина в RBD SARS-CoV-2, способствуя связыванию соседних ACE2 (Clausen et al., 2020). Предыдущие эксперименты показали, что HSPG являются важными молекулами клеточной поверхности, участвующими в проникновении в клетки SARS-CoV, обеспечивая сайты связывания для инвазии SARS-CoV на ранней стадии (Lang et al., 2011). Попадание коронавируса NL63 в клетки-хозяева зависит от взаимодействий HS, которые увеличивают плотность вируса на поверхности клетки.Проникновение коронавируса NL63 в клетки-хозяева достигается за счет использования ГАГ в качестве молекул адгезии для увеличения плотности вируса на поверхности клетки, что является примером патогенов, использующих ГАГ для выживания (Milewska et al., 2014). Сообщалось также, что другие микробные патогены, такие как коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) и грамотрицательная бактерия Pseudomonas aeruginosa (Park et al., 2001), которые могут вызывать респираторные инфекции, также взаимодействуют с ГАГ.

При повреждении кожного барьера ГАГ в месте раны изменяются и могут связываться с патогенами, такими как вирус полиомы клеток Меркеля (MCV) (Schowalter et al., 2011), S. aureus (Liang et al., 1992), Candida (Green et al., 2013) и Leishmania (Fatoux-Ardore et al., 2014). Примером может служить инфекция вирусом полиомы из клеток Меркеля (MCV). MCV – это круговой двухцепочечный ДНК-вирус и возбудитель карциномы из клеток Меркеля, которая является редким, но смертельным видом рака кожи. Когда MCV впервые прикрепляется к клеткам, он в основном связывается с HS на поверхности клетки и, в меньшей степени, связывается с CS. После обработки клеток гепараназой и хондроитиназным сульфатом инфекция MCV значительно страдает.Кроме того, другие заболевания связаны с взаимодействием ГАГ и патогенных микроорганизмов, включая энтероколит (Boyd et al., 1998), диарею (Viboud and Bliska, 2005), кератит (Hayashida et al., 2011) и СПИД (Hayashida). и др., 2015).

Диабетические осложнения

Диабет включает группу пожизненных метаболических заболеваний, характеризующихся хронической гипергликемией, вызванной множеством причин. Согласно статистике Всемирной организации здравоохранения, диабет – это заболевание с наибольшим количеством осложнений, включая диабетическую кардиопатию, диабетическую поверхность глаза и диабетическую стопу.Одним из наиболее серьезных осложнений у больных сахарным диабетом является диабетическая нефропатия. Диабетическая нефропатия – серьезное микрососудистое осложнение у пациентов с длительным диабетом. Длительная гипергликемия, вызванная диабетом, может привести к гликозилированию и неферментативному перекрестному связыванию белков и глюкозы или ее производных (Qiu et al., 2020). Ряд дальнейших сложных молекулярных перегруппировок приводит к необратимым конечным продуктам гликирования (AGE). AGE инициируют и ускоряют развитие почечной недостаточности, активируя рецептор конечных продуктов гликирования (RAGE).С помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) было обнаружено, что сродство RAGE к низкомолекулярным гепаринам (LMWH) было примерно в 6 раз выше, чем к AGE. Антагонистический эффект НМГ на RAGE помогает улучшить диабетическую нефропатию (Myint et al., 2006). Изменение проницаемости капиллярной стенки клубочка является ранним проявлением диабетической нефропатии, клинически проявляющейся аномальной протеинурией. Базальная мембрана клубочка содержит сильно отрицательно заряженные ГАГ, представленные HS, которые могут препятствовать прохождению заряженных макромолекул.Нейтрализация анионов в стенке капилляров клубочков связана с потерей зависимой от заряда селективности проницаемости клубочков. Снижение HS связано с увеличением экспрессии гена гепараназы-1 в гломерулярных эпителиальных клетках, индуцированной глюкозой, у пациентов с диабетической нефропатией. Гепарин или НМГ можно использовать в качестве ингибиторов гепариназы для эффективного устранения аномальной селективности проникновения клубочков и улучшения диабетической нефропатии (Lewis and Xu, 2008).

Мукополисахаридозы

Мукополисахаридозы (МПС) – это группа заболеваний, вызываемых аномальным накоплением ГАГ.Пациенты имеют генетические дефекты и не вырабатывают лизосомальные ферменты, которые разрушают метаболические ГАГ, или испытывают недостаток в них. В зависимости от дефицита фермента и симптомов МПС делятся на семь различных типов и более подтипов. К сожалению, никакие лекарства не могут вылечить эти заболевания. Большинство исследований посвящено ранней диагностике МПС. В настоящее время заместительная ферментная терапия и трансплантация гемопоэтических стволовых клеток в основном используются в клинике для контроля прогресса МПС и улучшения состояния пациентов (Zhou et al., 2020).

У пациентов с МПС ГАГ накапливаются в клетках, крови и тканях, что со временем приводит к появлению патологических симптомов. Однако точный механизм биологических взаимодействий с накопленными ГАГ и белками остается неясным. Самые последние исследования в этой области показали, что аномально накопленный HS у пациентов с MPS тесно связан с катепсином V и ингибирует его эластолитическую активность. Антагонист HS был способен восстанавливать активность катепсина V (Chazeirat et al., 2021). Новые результаты побуждают исследовать новые подходы к лечению MPS и связанных расстройств, основанных на молекулярном взаимодействии между GAG и белками.

Другие болезни

ГАГ также играют решающую роль в воспалительных процессах, неврологических заболеваниях (например, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера (БА) и коровьем бешенстве) и других заболеваниях. О важной роли ГАГ в воспалительной реакции сообщалось в предыдущих исследованиях. Поскольку структурная неоднородность HS обычно сосредоточена в области с высоким содержанием сульфатов, он может участвовать почти на каждой стадии прохождения лейкоцитов через стенку сосуда и может взаимодействовать с различными белками, такими как L-селектин, CXC-хемокиновый лиганд 8. (CXCL8) и гликопротеин, богатый гистидином (HRG) (Parish, 2006).Взаимодействие HA с CD44 и геном-6, стимулированным фактором некроза опухоли (TSG-6), активирует множество воспалительных клеток (Baranova et al., 2011), а HA также взаимодействует с Toll-подобным рецептором 4, способствуя высвобождению цитокины дендритными клетками (Taylor, Gallo, 2006). НМГ могут сочетаться с фактором некроза опухоли (TNF) и фактором ядерной транскрипции NF-kB для предотвращения экстравазации лейкоцитов (Luan et al., 2014). Более того, некоторые исследования показали, что ГАГ можно использовать для лечения БА и других возрастных деменций.ГАГ могут взаимодействовать с основным фактором роста фибробластов (FGF-2), VEGF, нейротрофическим фактором мозга (BDNF) и факторами роста тау (Huynh et al., 2019). Гепарин может ингибировать активность фермента, расщепляющего β-сайт APP (BACE1), чтобы снизить содержание β-амилоидного белка (Cui et al., 2011). Точно так же экстракт CS из Sardina pilchardus также может ингибировать BACE1 (Mycroft-West et al., 2020). Кроме того, ГАГ имеют большое значение при лечении синусита, астмы, хронической обструктивной болезни легких, муковисцидоза и первичной цилиарной дискинезии.Например, TSG-6, CD44 и Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) могут активироваться HA, что приводит к активации кальциевых каналов и иммунной активации (Garantziotis et al., 2016). Кроме того, снижение содержания сократительного белка в диафрагме и некоторых факторов роста, как сообщается, приводит к изменениям эпитопов гликозаминогликанов у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (Ottenheijm et al., 2007).

Как указано здесь, почти все типы основных заболеваний человека в большей или меньшей степени связаны с ГАГ.По-прежнему существует большая потребность в терапевтических средствах для лечения этих заболеваний. Понимание роли ГАГ в этих заболеваниях и знание того, как модулировать эти физиологические или патологические процессы с помощью искусственных ГАГ, может открыть эру открытия новых лекарств на основе ГАГ или нацеленных на ГАГ.

Гликозаминогликансвязывающие белки

Серпины

Ингибиторы протеиназ семейства серпинов играют важную роль в регуляции протеиназ в различных физиологических процессах, регулируя активность сериновых и цистеиновых протеиназ с помощью механизма конформационного улавливания, обеспечивая точную настройку времени и местоположения -зависимая регуляция активности протеиназ (Huntington, 2006).В плазме антитромбин III (AT III) и кофактор гепарина II (HC II) являются основными ингибиторами гепарин-зависимой протеазы, которые поддерживают текучесть крови за счет взаимодействия с GAG на клеточной поверхности. Антитромбин в сочетании с гепарином и HS вызывает антикоагуляцию, предотвращая активацию протеиназ свертывания крови в месте повреждения сосудов. В нормальных условиях антитромбин ингибирует протеиназы свертывания крови в состоянии подавленной реактивности, поскольку открытая петля реактивного центра (RCL) серпина обеспечивает только минимальные детерминанты специфичности для идентификации тромбина, фактора Ха и фактора IXa.Кроме того, неблагоприятные взаимодействия уменьшают благоприятные взаимодействия RCL и экзосайта с протеиназами. Комбинация специфического гепарина или HS с антитромбином может вызывать аллостерическую активацию, тем самым уменьшая неблагоприятные взаимодействия и способствуя матричному связыванию серпина и протеиназы (Olson et al., 2010). Сообщалось, что определенный белок-связывающий мотив и молекулярная основа антикоагулянтной функции гепарина включают специфическую пентасахаридную последовательность, которая может связываться с AT III.Требуется не менее 16 сахаридов гепариновой цепи, хотя необходим только пентасахарид (Guerrini et al., 2014). Взаимодействуя с AT III, гепарин усиливает опосредованное AT III ингибирование тромбина и фактора Ха. Инактивация этих протеаз с помощью AT III значительно ускоряется связыванием гепарина, увеличивая бимолекулярную константу скорости в 2000 раз (Rosenberg and Damus, 1973). Интересно, что гепарин также связывается с HC II, но не проявляет селективности. Вместо этого было выяснено, что последовательность уникального гексасахарида DS взаимодействует с HC II с высоким сродством (Maimone and Tollefsen, 1990; Raghuraman et al., 2010). Они снова продемонстрировали избирательность связывания между ГАГ и белками. Однако другие серпины, которые полагаются на связывание с GAGs для усиления их ингибирования, включают кофактор гепарина II, ингибитор протеина C и протеазный нексин I (Munoz and Linhardt, 2004; Rein et al., 2011).

Факторы роста

HSPG взаимодействуют с факторами роста [например, FGF (Huynh et al., 2019), VEGF (Gitay-Goren et al., 1992), трансформирующим фактором роста β (TGF- β ) ( Ли и др., 2015) и PDGF (Fager et al., 1992)], чтобы способствовать их биологической активности. Белки семейства FGF могут быть наиболее изученными гепарин-связывающими белками и обладают высоким сродством к HSPG на клеточной поверхности. FGF участвуют в онтогенетических и физиологических процессах посредством связывания FGFR на клеточной поверхности, а также GAG. Эти факторы роста, такие как кислый фактор роста фибробластов (FGF-1) и FGF-2, должны взаимодействовать с активным тройным комплексом, включающим канонические рецепторы (FGFR) и GAG на эндотелиальных поверхностных PG, и активироваться им.Затем три компонента FGF, FGFR и HS взаимодействуют одновременно с передачей сигнала, тем самым запуская деление клеток и их дальнейшую обработку (Fannon et al., 2000). Кроме того, взаимодействие GAG необходимо для стабилизации комплекса FGF-FGFR путем уравновешивания поверхностных зарядов. Это взаимодействие также в определенной степени ограничивает активность факторов роста. Фактически, связывание FGF достигается с помощью выбранных последовательностей (белок-связывающих мотивов) в основной цепи HS, хотя минимальные связывающие последовательности все еще остаются спорными (Pomin, 2016).Гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста, подобный фактору роста (HB-EGF), является членом семейства факторов роста EGF и взаимодействует с рецептором EGF, проявляя митогенную активность в различных типах клеток. Считается, что HB-EGF играет ключевую роль в продвинутых функциях мозга в центральной нервной системе (Oyagi and Hara, 2012), а также в образовании опухолей и других биологических процессах (Tsujioka et al., 2011).

Хемокины

Хемокины – это семейство небольших цитокинов, которые можно разделить на четыре группы, CXC, CC, C и CX3C, в соответствии с их общими структурными характеристиками и четырьмя остатками цистеина в консервативных местах.Некоторые хемокины могут быть индуцированы во время иммунного ответа, чтобы способствовать достижению клетками иммунной системы места инфекции, в то время как другие участвуют в контроле миграции клеток во время нормальных процессов поддержания или развития тканей (Mantovani et al., 2006). Эти белки взаимодействуют с трансмембранными рецепторами, связанными с G-белками (называемыми хемокиновыми рецепторами), чтобы проявлять свои биологические эффекты, включая избирательное привлечение и активацию клеток во время воспаления, стимуляцию дегрануляции лейкоцитов и стимулирование ангиогенеза или ангиостаза (Crijns et al., 2020). Местно продуцируемые хемокины связываются со своими хемокиновыми рецепторами и вызывают прилипание лейкоцитов к эндотелиальным клеткам с последующей экстравазацией лейкоцитов и последующей миграцией к участкам воспаления. Чтобы воздействовать на эндотелиальный слой кровеносных сосудов и сформировать градиент концентрации, хемокины должны связываться с GAG в эндотелиальных клетках и тканях (Johnson et al., 2005). Помимо PF4, который может приводить к HIT, другие важные члены семейства хемокинов (например, фактор-1a, полученный из стромальных клеток (SDF-1a) и хемоаттрактантный белок-1 моноцитов (MCP-1), также связываются с гепарином, хотя и с различная близость и специфичность.Например, исследования показали, что HS участвует в связывании и локализации SDF-1a на поверхности клетки. Впоследствии было обнаружено, что сульфатированный-ацетилированный-сульфатированный домен HS распознается рядом хемокинов, таких как IL-8, PF4 и MIP-1a (Gandhi and Mancera, 2008). Все больше данных подтверждают, что связывание и олигомеризация хемокинов с GAGs являются незаменимыми факторами активности хемокинов in vivo (Proudfoot et al., 2003). Было показано, что хемокины избирательны при взаимодействии с ГАГ.Например, для CCL5 порядок силы взаимодействия – гепарин, DS, HS и CS, в то время как мутантный CCL5 имеет пониженное сродство к гепарину. Исследования показали, что основными GAG-связывающими мотивами на хемокинах обычно являются BBXB или BBBXXBX, где B и X представляют собой основную аминокислоту и любую аминокислоту, соответственно (Hileman et al., 1998). Кроме того, были обнаружены специфические связывающие хемокины эпитопы на GAG, такие как 2-O-сульфатная группа на звене идуроновой кислоты, которая необходима для образования GAG-зависимого хемокина PF4 (Stringer and Gallagher, 1997).

Рецептор патогенов

Взаимодействие ГАГ со специфическими белками на поверхности различных патогенов, включая вирусы, бактерии, паразиты и грибы, позволяет микроорганизмам сделать первый шаг в установлении инфекции. Гепарин-связывающие адгезины, связанные с внутриклеточными патогенами, включая gpB, gpC и gpD вируса простого герпеса (HSV), gp120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), нитчатый гемагглютинин герпесвируса (FHA) Bordetella pertussis , поверхностный белок CS Plasmodium falciparum и трипаносомный адгезин пенетрин, вероятно, являются наиболее изученными белками (Rostand and Esko, 1997).Последовательности белка, участвующие во взаимодействии между HSV и HS, консервативны и функциональны в других гликопротеинах альфа-герпесвируса. CD4 является основным рецептором гликопротеина оболочки ВИЧ-1 gp120. Домены V3 и C4 gp120 содержат положительно заряженные области, которые могут агрегироваться в олигомерный gp120 с образованием сайтов связывания HS. Связывание гепарина и HS с белком Tat также важно при инфекции ВИЧ-1. Белок Tat является одним из основных белков репликации ВИЧ-1 и, как полагают, играет роль в запуске клеточной инфекции.Наименьший фрагмент гепарина, участвующий в связывании Tat, представляет собой гексасахарид. Следовательно, гепарин представляет собой соединение с «множеством мишеней», которое может влиять на различные аспекты ВИЧ-инфекции (Capila and Linhardt, 2002). Вирус денге вызывает несколько заболеваний человека, таких как лихорадка денге, и инфекция инициируется взаимодействием между белком денге E и белком, липидами или углеводным рецептором (ами) хозяина. Белок Е, который является основным антигеном, участвует в прикреплении вируса и других биологических процессах.Были выяснены структуры и сайты связывания антител белка E вируса денге, и результаты показали, что специфические углеводные остатки с сульфатированием являются общими структурами, разделяемыми CS-E и гепарином, и могут быть важными детерминантами для контроля проникновения вируса денге, опосредованного белком E. (Като и др., 2010).

Другие белки

Помимо вышеуказанных белков, другие белки также могут взаимодействовать с ГАГ, такие как молекулы адгезии, липидные или мембранно-связывающие белки, амилоидные белки и протеазы.Молекулы клеточной адгезии (CAM) представляют собой группу молекул, которые обеспечивают контакт и связывание между клетками или между клетками и внеклеточным матриксом, и их можно разделить на четыре основные группы: семейство интегринов, суперсемейство иммуноглобулинов, селектины (P, E, L) и кадгерины. Взаимодействие ГАГ с белками адгезии включает множество физиологических и патологических процессов. Например, тетрасахариды гепарина специфически блокируют взаимодействия L- и P-селектинов с антиген-сиалил-Lewis X-содержащими лигандами, которые проявляют противовоспалительную активность in vivo и предотвращают адгезию клеток рака толстой кишки к L- и P-селектину. (Norgard-Sumnicht et al., 1993). Аннексины принадлежат к семейству гомологичных белков, которые тесно связаны с клеточной мембраной, что указывает на их участие в различных процессах. Сообщалось о кальций-зависимой лектиновой активности (Kojima et al., 1996) и / или связывании со специфическими гликопротеинами и связывании аннексинов IV, V и VI с GAG (включая гепарин, HS или CS). Это взаимодействие основано не только на сродстве аннексина к полианионам, но также имеет структурную специфичность. Было обнаружено, что взаимодействие между октатиосульфатом сахарозы и аннексином V слабее, чем взаимодействие октасахарида, полученного из гепарина, и аннексина V в сочетании с гепарином и HS, но не CS, что подтвердило специфичность взаимодействия аннексина V и гепарина (Ishitsuka et al., 1998). Аполипопротеин E (ApoE) – важный белок, который может регулировать транспорт липидов в плазме крови человека и в головном мозге. Взаимодействие между ApoE и HSPG на клеточной поверхности важно для поглощения печенью остатков липопротеинов. HSPGs на поверхности клетки могут располагать обогащенные ApoE остаточные липопротеины к рецепторам посредством быстрой корреляции и разделения (Futamura et al., 2005), облегчая захват липопротеинов. Повышенный риск БА, связанный с ApoE4 (Arg112, Arg158), по-видимому, связан с изменениями гомеостаза амилоида-β (Aβ) (O’Callaghan et al., 2014). Взаимодействие между ApoE и рецептором липопротеинов низкой плотности (семейство LDLR) и HSPG также важно для событий передачи сигналов клеток (Tai et al., 2016). Связывание гепарина с нейтрофильной эластазой, сериновой протеазой, участвует в воспалении и легочных заболеваниях, и нацеливание на их сайт связывания привело к открытию многообещающих синтетических миметиков для лечения муковисцидоза (Morla et al., 2019).

Как специфические, так и неспецифические взаимодействия в ассоциациях белок / гликозаминогликан согласовывают две противоположные точки зрения, которые подчеркивают либо преобладание структурной комплементарности, подобной той, которая встречается во взаимодействиях белок / белок, либо электростатических сил.Огромная структурная неоднородность делает поиск специфических белковых «элементов распознавания» чрезвычайно сложной задачей. В то же время полианионная природа ГАГ подчеркивает роль плотности заряда как важной детерминанты сродства к ряду белков. На сегодняшний день идентифицировано большое количество GAG-связывающих белков. Обнаруживаются новые случаи взаимодействия GAG с белками, и обновленные данные по выбранным семействам GAG-связывающих белков суммированы в таблице 1.Из-за структурной неоднородности ГАГ отрицательно заряженные ГАГ имеют тенденцию неспецифично привлекать белки, и из-за специфичности различных последовательностей связывания белков разумно полагать, что еще существует множество неизвестных взаимодействий ГАГ-белок, ожидающих своего решения. обнаруженный.

ТАБЛИЦА 1 . Обобщено обновление выбранных семейств GAG-связывающих белков.

Таким образом, ГАГ взаимодействуют с широким спектром важных белков. Эти белки принадлежат к разным семействам и играют разные роли в физиологических или патологических процессах.Селективность является ключевым моментом при изучении связывания между ГАГ и белками. Поскольку ионная сила между отрицательными зарядами ГАГ и положительными зарядами белков является основой их взаимодействия, аномально сильно заряженные ГАГ, такие как гиперсульфатированный CS или гиперсульфатированный HS, обычно связываются с основными белками с высоким сродством, но с небольшой специфичностью, что вызывает неконтролируемый побочные эффекты при использовании в качестве лекарств. Выяснение и разработка определенной последовательности GAG, которая специфически взаимодействует с определенным белком, будет единственным правдоподобным способом разработки новых многообещающих терапевтических средств GAG.

Аналитические инструменты и подходы для характеристики взаимодействий ГАГ-белок

Очевидно, что безопасное и эффективное терапевтическое вмешательство при заболеваниях, связанных с ГАГ, зависит от выбора подходящих структур с желаемыми характеристиками и отсутствия вредных эффектов. Например, при использовании гепарина или родственных соединений для лечения COVID-19 лекарственные препараты-кандидаты должны обладать способностью препятствовать взаимодействию ACE2 / S-белка с небольшими вредными эффектами (например,, HIT, вызванный связыванием с PF4). Эту работу могут значительно облегчить аналитические инструменты, которые предоставляют подробную информацию о взаимодействиях между лекарствами-кандидатами и их терапевтическими целями.

В настоящее время разработаны и применяются многочисленные аналитические подходы для выявления молекулярного механизма и последовательности связывания комплексов GAG-белок (Yang and Chi, 2017). Аффинные подходы, такие как аффинная хроматография, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и калориметрия изотермического титрования (ITC), используются для измерения силы связывания между GAG и белками.ЯМР-спектроскопия и рентгеновская кристаллография могут предоставить чрезвычайно ценную информацию о взаимодействиях GAG-белок, обеспечивая структурные и конформационные данные, которые полезны для определения точных точек контакта между взаимодействующими молекулами. Платформа микроматрицы и молекулярная стыковка являются мощными инструментами для скрининга белковых взаимодействий с большими библиотеками структур GAG, а сложные динамические детали событий молекулярного уровня могут быть визуализированы с относительно небольшими затратами времени и средств.Однако структурная гетерогенность ГАГ и обширное гликозилирование вовлеченных белков все еще затрудняют открытие специфичности связывающей последовательности.

Методы МС имеют несколько уникальных преимуществ в характеристике комплексов ГАГ-белок благодаря их превосходной чувствительности, устойчивости к более низкой чистоте образца и способности характеризовать аминокислотные / сахарные остатки и модификации. Спектроскопия ионной подвижности (IMS) (Gray et al., 2016), отслеживание гидроксильных радикалов (HRF) (Li et al., 2015) и перекрестно-связывающий МС (Yang et al., 2012) были использованы для изучения взаимодействий между GAG и белками. Недавно отечественная масс-спектрометрия использовалась в качестве инструмента для поддержки механистических исследований взаимодействий лекарств и терапевтических мишеней (Tong and Wang, 2018). Использование газофазных ионных манипуляций (ограниченное снижение заряда) и молекулярного моделирования для дополнения нативного МС позволило получить значимую информацию о комплексе, образованном ACE2 и S-белком, и о роли гепарина в разрушении связывания ACE2 / RBD (Yang et al., 2020). Для поддержания химического разнообразия гепарина был использован подход «сверху вниз», позволяя сложным длинным цепям взаимодействовать с целевым белком. После энзимолиза белок-связывающие цепи гепарина анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии с онлайн-масс-спектрометрическим детектированием (SEC / MS) (Niu et al., 2020), которая выявила олигомеры, которые не были расщеплены лизисом из-за их связывания с белка и позволил охарактеризовать длину цепи и сульфатные и ацетильные группы. Некоторые из новейших методов масс-спектрометрии и их применения во взаимодействиях GAG-белок показаны в таблице 2.

ТАБЛИЦА 2 . Обобщены последние достижения в области аналитических инструментов на основе масс-спектрометрии.

Еще одна развивающаяся область – разработка вычислительных инструментов для облегчения изучения взаимодействий GAG-белок. В отличие от белков, ГАГ обладают высокой степенью заряда и гибкостью с точки зрения подтверждения. Следовательно, трудно получить высококачественные сокристаллы комплексов ГАГ-белок. Вычислительные подходы предоставляют альтернативный способ прогнозирования паттернов связывания, а остатки вносят вклад в связывание.Систематическое исследование было проведено путем компьютерной характеристики всех известных связываний с GAG-белками из банка данных о белках, что доказало выполнимость вычислительной методологии (Bojarski et al., 2019). Кроме того, была разработана методология GAG-Dock для оценки связывания между различными лигандами GAG и рецепторами, которые необходимы для роста аксонов, и были представлены их правдоподобные структуры (Griffith et al., 2017). Наша группа также применила подход молекулярной стыковки для объяснения фармакокинетического поведения гепарина у пациентов с диабетом путем моделирования связывания гепарина и гликированного сывороточного альбумина человека (Qiu et al., 2020). Компьютерное исследование связывания GAG-белка также полезно для разработки потенциальных терапевтических средств, таких как небольшие сульфатированные молекулы, имитирующие функцию GAG (Nagarajan et al., 2017). Действительно, вычислительная методология стала чрезвычайно полезной и легко доступной для исследователей, не связанных с вычислениями (Sankaranarayanan et al., 2018).

Терапевтические средства, нацеленные на специфические взаимодействия ГАГ-белок

Конечная цель изучения взаимодействия между ГАГ и белками состоит в разработке новых терапевтических средств из этой многообещающей, но недостаточно изученной области.Схематическая стратегия показана на рисунке 3. Фактически, некоторые терапевтические средства, направленные на специфические взаимодействия GAG-белок, включая олигосахариды GAG и синтетические аналоги, удаление или модификация GAG ферментами, экзогенный гепарин / HS или синтетические миметики GAG в качестве конкурентных ингибиторов, катионные белки и др. полимеры в качестве антагонистов HS и низкомолекулярные антагонисты гепарина и HS в настоящее время разрабатываются или применяются для лечения родственных заболеваний.

РИСУНОК 3 .Схематическая стратегия разработки новых терапевтических средств, основанная на специфическом взаимодействии между ГАГ и белками. (A) Обнаружение связывания ГАГ с белками. (B) Выяснение молекулярного механизма между связыванием. (C) Синтез специфических олигосахаридов GAG или аналогов. (D) Оценка эффективности и токсичности in vitro и in vivo .

Применение олигосахаридов гепарина и синтетических аналогов является важным аспектом клинического лечения многих заболеваний.HP и LMWH давно используются в качестве антикоагулянтов (Hirsh et al., 2001). Синтетический пентасахарид арикстра (фондапаринукс) связывается с АТ и имеет лучшую эффективность при низких дозах (Walenga et al., 2002). Кроме того, некоторые терапевтические применения гепарина и его производных помимо антикоагуляции были исследованы у пациентов с бронхиальной астмой, хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и раком. Противовоспалительное, антиоксидантное и лизогенное действие гепарина, вводимого путем ингаляции, может изменить прогрессирование ХОБЛ и астмы (Shute et al., 2018).

Было исследовано несколько различных стратегий для нацеливания взаимодействий HS и белков, включая удаление HS или модификацию ферментами (Rek et al., 2009). Было показано, что некоторые ферменты гепарина (такие как бактериальные гепариназы и эндосульфатазы млекопитающих) являются потенциальными ингибиторами взаимодействий HS-белок. Терапия гепариназой также использовалась для подавления роста / метастазирования опухоли и заболеваний, связанных с амилоидом. Клетки, обработанные гепариназой, могут противостоять присоединению или проникновению нескольких HS-связывающих патогенов, включая вирусы, бактерии и паразиты (Weiss et al., 2017).

Другой способ подавления взаимодействий HS-белок – использование экзогенного гепарина / HS или синтетических аналогов GAG в качестве конкурентных ингибиторов. Экзогенное добавление гепарина и цепей HS может подавлять инфицирование клеток-хозяев HS-связывающими патогенами, такими как HSV, HPV, гепатит B и различные бактерии. Кроме того, рост и метастазирование раковых клеток могут быть заблокированы HS и гепарином. НМГ и миметики HS (Lee et al., 1999), такие как сульфат рамнана, показали противоопухолевую и противовирусную активность, что было многообещающим при тестировании in vitro .

Катионные белки и фолдамеры использовались в качестве антагонистов взаимодействий HS-белок. Эти молекулы зависят от электростатических взаимодействий между их положительно заряженными функциональными группами и высокоанионными сульфатными и карбоксильными группами гепарина и HS. Лактоферрин (Lonnerdal and Iyer, 1995) был протестирован для нейтрализации гепарина и противодействия определенным взаимодействиям HS-белок. Протамин (Taylor and Folkman, 1982), как было продемонстрировано, является мощным антагонистом взаимодействия GAG-белок и использовался в клинической практике для отмены антикоагулянтов.

Некоторые низкомолекулярные препараты были разработаны как антагонисты HS-белка из-за их специфических характеристик и преимуществ. Например, было обнаружено, что производное диспиротрипиперазина (DSTP 27) (Schmidtke et al., 2003) связывает HS на клеточной поверхности и ингибирует прикрепление и абсорбцию некоторых вирусов, а также блокирует HS-зависимое вирусное прикрепление вируса HPV в долгосрочной перспективе.

Заключение и отметки

ГАГ участвуют в большом количестве биологических процессов и играют важную роль в росте и развитии, поддержании гомеостаза и сопротивлении болезням.ГАГ влияют на клеточную адгезию, миграцию, передачу сигнала и другие биологические активности посредством взаимодействия с белками, такими как факторы роста и факторы адгезии, тем самым влияя на многочисленные физиологические активности. Из-за разнообразия типов и функций белков, которые взаимодействуют с ГАГ, ГАГ выполняют множество биологических функций. Возникновение и развитие многих заболеваний, от вторжения патогенов до возникновения и развития опухолей, связаны с ГАГ.Выяснение конкретной последовательности и механизма взаимодействия ГАГ с белками имеет важное значение для поиска новых терапевтических средств, направленных на конкретные взаимодействия ГАГ-белок.

Взгляд в будущее и будущее

Исследования, разработка и рынок препаратов на основе углеводов, особенно препаратов на основе ГАГ, далеко отстают от препаратов на основе белка. За исключением препаратов гепарина в качестве антикоагулянтов, немногие ГАГ широко используются в клинике, хотя ГАГ проявляют широкий спектр биоактивности. Однако сейчас ситуация меняется.С развитием аналитических инструментов и синтетических / биосинтетических подходов, идентификация конкретной последовательности и получение достаточно структурированных однородных олигосахаридов GAG становится возможным. В ближайшие пять-десять лет мы можем ожидать, что довольно много миметиков GAG или GAG пройдут клинические испытания. Это ускорит исследования GAG и приведет к новым решениям для болезней, которые трудно вылечить с помощью существующих низкомолекулярных или белковых препаратов.

Вклад авторов

Все авторы внесли свой вклад в эту работу и одобрили ее для публикации.

Финансирование

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (21877072) и Фондом естественных наук провинции Шаньдун (ZR2019MB014).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Xiaojun Sun за вычитку рукописи.

Ссылки

Анттила, М. А., Тамми, Р. Х., Тамми, М. И., Сирянен, К. Дж., Саарикоски, С. В., и Косма, В. М. (2000). Высокий уровень стромального гиалуронана предсказывает плохой исход заболевания при эпителиальном раке яичников. Cancer Res. 60 (1), 150–155.

PubMed AbstractGoogle Scholar

Auvinen, P., Tammi, R., Parkkinen, J., Tammi, M., Agren, U., Johansson, R., et al. (2000). Гиалуронан в перитуморальной строме и злокачественных клетках связан с распространением рака груди и предсказывает выживаемость. Am. J. Pathol. 156 (2), 529–536. DOI: 10.1016 / S0002-9440 (10) 64757-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Banerjee, M., Copp, J., Vuga, D., Marino, M., Chapman, T., van der Geer, P., et al. (2004). GW-домены белка инвазии Listeria monocytogenes InlB необходимы для усиления активации met. Мол. Microbiol. 52 (1), 257–271. doi: 10.1111 / j.1365-2958.2003.03968.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баранова Н.S., Nileback, E., Haller, F.M, Briggs, D.C., Svedhem, S., Day, A.J., et al. (2011). Связанный с воспалением белок TSG-6 связывает гиалуронан через индуцированные гиалуронаном олигомеры TSG-6. J. Biol. Chem. 286 (29), 25675–25686. doi: 10.1074 / jbc.M111.247395

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Barth, H., Schafer, C., Adah, M. I., Zhang, F., Linhardt, R.J., Toyoda, H., et al. (2003). Для клеточного связывания гликопротеина E2 оболочки вируса гепатита С требуется гепарансульфат на клеточной поверхности. J. Biol. Chem. 278 (42), 41003–41012. doi: 10.1074 / jbc.M302267200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bojarski, K. K., Becher, J., Riemer, T., Lemmnitzer, K., Moller, S., Schiller, J., et al. (2019). Синтез и исследование in silico искусственно фосфорилированных гликозаминогликанов. J. Mol. Struct. 1197, 401–416. doi: 10.1016 / j.molstruc.2019.07.064

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Boyd, A.П., Сори, М. П., Ириарте, М., и Корнелис, Г. Р. (1998). Гепарин препятствует транслокации белков Yop в клетки HeLa и связывается с LcrG, регуляторным компонентом аппарата Yersinia Yop. Мол. Microbiol. 27 (2), 425–436. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.1998.00691.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цай, Ю., Чжан, X., Шен, Дж., Цзян, Б., Ху, Д., и Чжао, М. (2020). Гепарин-связывающий белок: новый биомаркер, связывающий четыре различных сердечно-сосудистых заболевания. Cardiol. Res. Практик. 2020, 9575373. doi: 10.1155 / 2020/9575373

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chazeirat, T., Denamur, S., Bojarski, K. K., Andrault, P.M., Sizaret, D., Zhang, F., et al. (2021 г.). Аномальное накопление гепарансульфата у пациентов с мукополисахаридозом препятствует эластолитической активности катепсина V. Carbohydr. Polym. 253, 117261. doi: 10.1016 / j.carbpol.2020.117261

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Clausen, T.M., Christoffersen, S., Dahlback, M., Langkilde, A. E., Jensen, K. E., Resende, M., et al. (2012). Структурные и функциональные сведения о том, как белок VAR2CSA Plasmodium falciparum опосредует связывание с хондроитинсульфатом А при плацентарной малярии. J. Biol. Chem. 287 (28), 23332–23345. doi: 10.1074 / jbc.M112.348839

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Clausen, T. M., Sandoval, D. R., Spliid, C. B., Pihl, J., Perrett, H. R., Painter, C. D., et al.(2020). Инфекция SARS-CoV-2 зависит от клеточного гепарансульфата и ACE2. Ячейка 183 (4), 1043–1057. doi: 10.1016 / j.cell.2020.09.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цуй, Х., Хунг, А. К., Клавер, Д. В., Сузуки, Т., Фриман, К., и Наркович, К. (2011). Влияние гепарина и эноксапарина на процессинг АРР и продукцию Abeta в первичных корковых нейронах мышей Tg2576. PLoS One 6 (7), e23007. doi: 10.1371 / journal.pone.0023007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Dalrymple, N., и Макков, Э. Р. (2011). Продуктивная инфекция эндотелиальных клеток человека вирусом денге направляется гепарансульфатсодержащими протеогликановыми рецепторами. J. Virol. 85 (18), 9478–9485. doi: 10.1128 / JVI.05008-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Де Паскуале, В., и Павоне, Л. М. (2020). Передача сигналов протеогликана гепарансульфата в микросреде опухоли. Внутр. J. Mol. Sci. 21 (18), 6588. doi: 10.3390 / ijms21186588

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Derler, R., Гесслбауэр, Б., Вебер, К., Струцманн, Э., Миллер, И., и Кунгл, А. (2017). Опосредованная гликозаминогликанами передача сигналов связывания CXCL8 с эндотелиальными клетками ниже по течению. Внутр. J. Mol. Sci. 18 (12), 2605. doi: 10.3390 / ijms18122605

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Dymarska, M., Juros, W., Janeczko, T., and Kostrzewa-Suslow, E. (2016). Гиалуроновая кислота. Структура, свойства и использование. Przem. Chem. 95 (4), 814–816. doi: 10.15199 / 62.2016.4.19

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эдвардс, И.Дж., Вагнер, Дж. Д., Фогл-Уиллис, К. А., Литвак, К. Н., и Чефалу, В. Т. (2004). Гепарансульфат артериальной крови отрицательно связан с гипергликемией и атеросклерозом у диабетических обезьян. Cardiovasc. Диабетол. 3, 6. doi: 10.1186 / 1475-2840-3-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fager, G., Camejo, G., Olsson, U., Ostergren-Lunden, G., and Bondjers, G. (1992). Гепарин-подобные гликозаминогликаны влияют на рост и фенотип гладкомышечных клеток артерий человека in vitro .II. А-цепь тромбоцитарного фактора роста содержит последовательность, которая специфически связывает гепарин. Vitro Cell. Dev. Биол. 28A (3 Pt 1), 176–180. doi: 10.1007 / BF02631088

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fannon, M., Forsten, K. E., and Nugent, M. A. (2000). Потенцирование и ингибирование связывания bFGF гепарином: модель регуляции клеточного ответа. Биохимия 39 (6), 1434–1445. doi: 10.1021 / bi991895z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Farwell, S.Л. Н., Рейландер, К. Г., Айовин, М. К., и Лоу-Кренц, Л. Дж. (2017). Новый трансмембранный белок 184a рецептора гепарина регулирует ангиогенез в хвостовом плавнике взрослых рыбок данио. Фронт. Physiol. 8, 671. doi: 10.3389 / fphys.2017.00671

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fatoux-Ardore, M., Peysselon, F., Weiss, A., Bastien, P., Pratlong, F., and Ricard-Blum, S. (2014). Крупномасштабное исследование сетей взаимодействия Leishmania с внеклеточным матриксом хозяина с помощью поверхностной плазмонной резонансной томографии. Заражение. Иммун. 82 (2), 594–606. doi: 10.1128 / IAI.01146-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Futamura, M., Dhanasekaran, P., Handa, T., Phillips, M.C., Lund-Katz, S., and Saito, H. (2005). Двухступенчатый механизм связывания аполипопротеина E с гепарином: последствия для кинетики образования комплекса аполипопротеина E-гепарансульфат протеогликана на поверхности клеток. J. Biol. Chem. 280 (7), 5414–5422. doi: 10.1074 / jbc.M411719200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ганди, Н.С., и Мансера, Р. Л. (2008). Строение гликозаминогликанов и их взаимодействие с белками. Chem. Биол. Drug Des. 72 (6), 455–482. doi: 10.1111 / j.1747-0285.2008.00741.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Garantziotis, S., Brezina, M., Castelnuovo, P., and Drago, L. (2016). Роль гиалуронана в патобиологии и лечении респираторных заболеваний. Am. J. Physiol. Легочная клетка. Мол. Physiol. 310 (9), L785 – L795.doi: 10.1152 / ajplung.00168.2015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Gitay-Goren, H., Soker, S., Vlodavsky, I., and Neufeld, G. (1992). Связывание фактора роста эндотелия сосудов с его рецепторами зависит от гепариноподобных молекул, связанных с клеточной поверхностью. J. Biol. Chem. 267 (9), 6093–6098. doi: 10.1016 / s0021-9258 (18) 42666-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грей, К. Дж., Томас, Б., Аптон, Р., Migas, L.G., Eyers, C.E., Barran, P.E. и др. (2016). Применение масс-спектрометрии ионной подвижности для высокопроизводительного анализа гликанов с высоким разрешением. Biochim. Биофиз. Acta 1860 (8), 1688–1709. doi: 10.1016 / j.bbagen.2016.02.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грин, Дж. В., Орсборн, К. И., Чжан, М., Тан, К. К., Грейс, К. Д., Поролло, А., и др. (2013). Гепарин-связывающие мотивы и образование биопленок Candida albicans. Дж.Заразить. Дис. 208 (10), 1695–1704. doi: 10.1093 / infdis / jit391

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гриффит А. Р., Роджерс К. Дж., Миллер Г. М., Аброл Р., Хси-Уилсон Л. К. и Годдард В. А. (2017). Прогнозирование взаимодействий с поверхностными белками гликозаминогликанов и их значение для изучения роста аксонов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 114 (52), 13697–13702. doi: 10.1073 / pnas.1715093115

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Геррини, М., Мурье, П. А., Торри, Г., Висков, К. (2014). Антитромбин-связывающие олигосахариды: структурные различия в уникальной функции? Glycoconj. J. 31 (6–7), 409–416. doi: 10.1007 / s10719-014-9543-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hayashida, A., Amano, S., Gallo, R. L., Linhardt, R. J., Liu, J., and Park, P. W. (2015). 2-O-сульфатные домены в гепарансульфате синдекана-1 ингибируют кателицидин нейтрофилов и способствуют инфицированию роговицы Staphylococcus aureus . J. Biol. Chem. 290 (26), 16157–16167. doi: 10.1074 / jbc.M115.660852

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hayashida, A., Amano, S., and Park, P. W. (2011). Синдекан-1 способствует инфицированию роговицы Staphylococcus aureus , противодействуя нейтрофил-опосредованной защите хозяина. J. Biol. Chem. 286 (5), 3288–3297. doi: 10.1074 / jbc.M110.185165

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hileman, R.Е., Фромм, Дж. Р., Вейлер, Дж. М., и Линхардт, Р. Дж. (1998). Взаимодействия гликозаминогликанов с белками: определение консенсусных сайтов в белках, связывающих гликозаминогликаны. Bioessays 20 (2), 156–167. doi: 10.1002 / (SICI) 1521-1878 (199802) 20: 2 <156 :: AID-BIES8> 3.0.CO; 2-R

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hirsh, J., Warkentin, T. E., Shaughnessy, S. G., Anand, S. S., Halperin, J. L., Raschke, R., et al. (2001). Гепарин и низкомолекулярный гепарин: механизмы действия, фармакокинетика, дозирование, мониторинг, эффективность и безопасность. Комод 119 (доп. Л), 64S – 94S. doi: 10.1378 / Chess.119.1_suppl.64s

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Huang, T. Y., Irene, D., Zulueta, M. M., Tai, T. J., Lain, S. H., Cheng, C. P., et al. (2017). Структура комплекса между гепарансульфатоктасахаридом и микобактериальным гепарин-связывающим гемагглютинином. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 56 (15), 4192–4196. doi: 10.1002 / anie.201612518

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Huynh, M.Б., Уиджа, М. О., Шантепи, С., Карпентье, Г., Майза, А., Чжан, Г. и др. (2019). Гликозаминогликаны из гиппокампа при болезни Альцгеймера изменили способность связывать и регулировать активность факторов роста и связывать тау. PLoS One 14 (1), e0209573. doi: 10.1371 / journal.pone.0209573

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ishitsuka, R., Kojima, K., Utsumi, H., Ogawa, H., and Matsumoto, I. (1998). Гликозаминогликановые связывающие свойства аннексинов IV, V и VI. J. Biol. Chem. 273 (16), 9935–9941. doi: 10.1074 / jbc.273.16.9935

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Johnson, Z., Proudfoot, A. E., and Handel, T. M. (2005). Взаимодействие хемокинов и гликозаминогликанов: новый поворот в регуляции функции хемокинов с возможностями терапевтического вмешательства. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (6), 625–636. doi: 10.1016 / j.cytogfr.2005.04.006

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Karjalainen, J.М., Тамми, Р. Х., Тамми, М. И., Эскелинен, М. Дж., Агрен, У. М., Парккинен, Дж. Дж. И др. (2000). Снижение уровня CD44 и гиалуронана связано с неблагоприятным прогнозом при меланоме кожи I клинической стадии. Am. J. Pathol. 157 (3), 957–965. DOI: 10.1016 / S0002-9440 (10) 64608-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Катагири Ю., Морган А. А., Ю П., Бангаян Н. Дж., Джунка Р. и Геллер Х. М. (2018). Идентификация новых сайтов связывания гепарина в рецепторной протеин-тирозинфосфатазе (RPTPsigma): значение для передачи сигналов протеогликана. J. Biol. Chem. 293 (29), 11639–11647. doi: 10.1074 / jbc.RA118.003081

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Като, Д., Эра, С., Ватанабе, И., Арихара, М., Сугиура, Н., Кимата, К. и др. (2010). Противовирусная активность хондроитинсульфата Е в отношении белка оболочки вируса денге. Antiviral Res 88 (2), 236–243. doi: 10.1016 / j.antiviral.2010.09.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, С.Ю., Джин, В., Суд, А., Монтгомери, Д. В., Грант, О. К., Фустер, М. М. и др. (2020). Гликозаминогликановый связывающий мотив в сайте протеолитического расщепления S1 / S2 на гликопротеине-шипе может способствовать проникновению в хозяйскую клетку нового коронавируса (SARS-CoV-2). bioRxiv [Epub перед печатью]. doi: 10.1101 / 2020.04.14.041459

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кинес, Р. К., Томпсон, К. Д., Лоуи, Д. Р., Шиллер, Дж. Т. и Дэй, П. М. (2009). Первые шаги, ведущие к папилломавирусной инфекции, происходят на базальной мембране до связывания с клеточной поверхностью. Proc. Natl. Акад. Sci. США 106 (48), 20458–20463. DOI: 10.1073 / pnas.0

2106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kleeff, J., Ishiwata, T., Kumbasar, A., Friess, H., Buchler, M. W., Lander, A. D., et al. (1998). Гепарансульфат-протеогликан-1 на клеточной поверхности регулирует действие фактора роста в клетках карциномы поджелудочной железы и сверхэкспрессируется при раке поджелудочной железы человека. J. Clin. Инвестировать. 102 (9), 1662–1673. doi: 10.1172 / JCI4105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кодзима, К., Ямамото, К., Иримура, Т., Осава, Т., Огава, Х., и Мацумото, И. (1996). Характеристика углеводсвязывающего белка p33 / 41: связь с аннексином IV, молекулярная основа дублетных форм (p33 и p41) и модуляция активности связывания углеводов фосфолипидами. J. Biol. Chem. 271 (13), 7679–7685. doi: 10.1074 / jbc.271.13.7679

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kosunen, A., Ropponen, K., Kellokoski, J., Pukkila, M., Virtaniemi, J., Valtonen, H., et al. (2004). Сниженная экспрессия гиалуронана является сильным показателем плохой выживаемости при плоскоклеточном раке полости рта. Oral Oncol. 40 (3), 257–263. DOI: 10.1016 / j.oraloncology.2003.08.004

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lang, J., Yang, N., Deng, J., Liu, K., Yang, P., Zhang, G., et al. (2011). Подавление проникновения в клетки псевдовируса SARS путем связывания лактоферрина с гепарансульфат-протеогликанами. PLoS One 6 (8), e23710.doi: 10.1371 / journal.pone.0023710

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lee, J. B., Hayashi, K., Hayashi, T., Sankawa, U., and Maeda, M. (1999). Противовирусная активность против HSV-1, HCMV и HIV-1 сульфата рамнана из Monostroma latissimum . Planta Med. 65 (5), 439–441. doi: 10.1055 / s-2006-960804

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Дж., Ви, С., Гунаратне, Дж., Чуа, Р. Дж., Смит, Р.А., Линг Л. и др. (2015). Структурные детерминанты взаимодействий гепарин-трансформирующего фактора роста-бета1 и их влияние на передачу сигналов. Гликобиология 25 (12), 1491–1504. doi: 10.1093 / glycob / cwv064

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Льюис, Э. Дж., И Сюй, X. (2008). Аномальные характеристики проницаемости клубочков при диабетической нефропатии: значение для терапевтического использования низкомолекулярного гепарина. Уход за диабетом 31 (Доп.2), S202 – S207. doi: 10.2337 / dc08-s251

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Li, Z., Moniz, H., Wang, S., Ramiah, A., Zhang, F., Moremen, K. W., et al. (2015). Футпринтинг белков гидроксильных радикалов с высоким структурным разрешением показывает расширенный интерфейс связывания Robo1-гепарина. J. Biol. Chem. 290 (17), 10729–10740. doi: 10.1074 / jbc.M115.648410

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лян, О. Д., Асенсио, Ф., Франссон, Л. А., и Вадстром, Т. (1992). Связывание гепарансульфата с Staphylococcus aureus . Заражение. Иммун. 60 (3), 899–906. doi: 10.1128 / IAI.60.3.899-906.1992

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lindahl, U., Couchman, J., Kimata, K., Esko, J. D., Varki, R.A., Cummings, R.D., et al. (2015). «Протеогликаны и сульфатированные гликозаминогликаны» в Основы гликобиологии . Редактор. С. Дарвилл Шнаар (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Колд-Спринг-Харбор), 207–221.

Google Scholar

Лю Дж., Ли Дж., Арнольд К., Павлински Р. и Ки Н. С. (2020). Использование молекул гепарина для борьбы с COVID-2019. Res. Практик. Тромб. Гемост. 4 (4), 518–523. doi: 10.1002 / rth3.12353

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю, К., Сомия, М., Иидзима, М., Татэмацу, К., и Курода, С. (2018). Полученный из вируса гепатита В гепарин-связывающий пептид человека, специфичный к клеткам печени: идентификация и применение в системе доставки лекарств. Biomater. Sci. 7 (1), 322–335. doi: 10.1039 / c8bm01134f

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Луан, З. Г., Наранпурев, М., и Ма, X. C. (2014). Лечение низкомолекулярным гепарином подавляет системное воспаление и предотвращает вызванное эндотоксином острое повреждение легких у крыс. Воспаление 37 (3), 924–932. doi: 10.1007 / s10753-014-9812-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ma, S. N., Mao, Z.X., Wu, Y., Liang, M. X., Wang, D. D., Chen, X., et al. (2020). Противораковые свойства гепарина и его производных: обзор и перспективы. Cell Adh. Мигр. 14 (1), 118–128. doi: 10.1080 / 19336918.2020.1767489

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маймон М. М. и Толлефсен Д. М. (1990). Структура гексасахарида дерматансульфата, который связывается с кофактором гепарина II с высоким сродством. J. Biol. Chem. 265 (30), 18263–18271.DOI: 10.1016 / S0021-9258 (17) 44747-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Mantovani, A., Bonecchi, R., and Locati, M. (2006). Регулировка воспаления и иммунитета с помощью секвестрации хемокинов: приманки и многое другое. Nat. Rev. Immunol. 6 (12), 907–918. DOI: 10.1038 / nri1964

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Matsuda, K., Maruyama, H., Guo, F., Kleeff, J., Itakura, J., Matsumoto, Y., et al. (2001). Глипикан-1 сверхэкспрессируется при раке груди человека и модулирует митогенные эффекты нескольких гепарин-связывающих факторов роста в клетках рака груди. Cancer Res. 61 (14), 5562–5569.

PubMed AbstractGoogle Scholar

Milewska, A., Zarebski, M., Nowak, P., Stozek, K., Potempa, J., and Pyrc, K. (2014). Человеческий коронавирус NL63 использует протеогликаны гепарансульфата для прикрепления к клеткам-мишеням. J. Virol. 88 (22), 13221–13230. doi: 10.1128 / JVI.02078-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Морла, С. (2019). Гликозаминогликаны и миметики гликозаминогликанов при раке и воспалении. Внутр. J. Mol. Sci. 20 (8), 1963. doi: 10.3390 / ijms20081963

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Морла, С., Шанкаранараян, Н. В., Афоса, Д. К., Кумар, М., Куммарапуругу, А. Б., Войнов, Дж. А. и др. (2019). В процессе обнаружения выводов, нацеленных на гепарин-связывающий сайт эластазы нейтрофилов в мокроте пациентов с муковисцидозом. J. Med. Chem. 62 (11), 5501–5511. doi: 10.1021 / acs.jmedchem.9b00379

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Mycroft-West, C.J., Devlin, A.J., Cooper, L.C., Procter, P., Miller, G.J., Fernig, D.G., et al. (2020). Ингибирование BACE1, бета-секретазы, вызывающей болезнь Альцгеймера, с помощью экстракта хондроитинсульфата из Sardina pilchardus. Neural Regen. Res. 15 (8), 1546–1553. doi: 10.4103 / 1673-5374.274341

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Myint, K. M., Yamamoto, Y., Doi, T., Kato, I., Harashima, A., Yonekura, H., et al. (2006). RAGE контроль диабетической нефропатии на мышиной модели: эффекты разрушения гена RAGE и введение низкомолекулярного гепарина. Диабет 55 (9), 2510–2522. doi: 10.2337 / db06-0221

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нагараджан Б., Шанкаранараян Н. В., Патель Б. Б. и Десаи У. Р. (2017). Алгоритм на основе молекулярной динамики для оценки способности имитировать гликозаминогликаны синтетических, гомогенных, сульфатированных малых молекул. PLoS One 12 (2), e0171619. doi: 10.1371 / journal.pone.0171619

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Niu, C., Чжао, Ю., Бобст, К. Э., Савинов, С. Н., Калташов, И. А. (2020). Идентификация элементов распознавания белков в цепях гепарина с использованием ферментативной печати стоп в растворе и онлайн-SEC / MS. Анал. Chem. 92 (11), 7565–7573. doi: 10.1021 / acs.analchem.0c00115

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Norgard-Sumnicht, K. E., Varki, N. M., and Varki, A. (1993). Кальций-зависимые гепариноподобные лиганды для L-селектина в нелимфоидных эндотелиальных клетках. Наука 261 (5120), 480–483. doi: 10.1126 / science.7687382

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

O’Callaghan, P., Noborn, F., Sehlin, D., Li, J. P., Lannfelt, L., Lindahl, U., et al. (2014). Аполипопротеин E увеличивает клеточную ассоциацию бета-амилоида 40 через гепарансульфат и LRP1-зависимые пути. Амилоид 21 (2), 76–87. doi: 10.3109 / 13506129.2013.879643

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Олсон, С.Т., Ричард Б., Изагирре Г., Шедин-Вайс С. и Геттинс П. Г. (2010). Молекулярные механизмы антитромбин-гепариновой регуляции протеиназ свертывания крови. Парадигма для понимания регуляции протеиназы ингибиторами протеиназ семейства серпинов. Biochimie 92 (11), 1587–1596. doi: 10.1016 / j.biochi.2010.05.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ottenheijm, C.A., Jenniskens, G.J., Geraedts, M.C., Hafmans, T., Heunks, L.М., ван Куппевельт, Т. Х. и др. (2007). Дисфункция диафрагмы при хронической обструктивной болезни легких: роль гепарансульфата? Eur. Респир. J. 30 (1), 80–89. doi: 10.1183 / 036.00125106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ояги А. и Хара Х. (2012). Важные роли гепарин-связывающего эпидермального фактора роста, подобного фактору роста в головном мозге. CNS Neurosci. Ther. 18 (10), 803–810. DOI: 10.1111 / j.1755-5949.2012.00371.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Park, P. W., Pier, G. B., Hinkes, M. T., and Bernfield, M. (2001). Использование выделения синдекана-1 с помощью Pseudomonas aeruginosa усиливает вирулентность. Nature 411 (6833), 98–102. doi: 10.1038 / 35075100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Pillarisetti, S. (2000). Липопротеиновая модуляция субэндотелиальных протеогликанов гепарансульфата (перлекана) и атерогенность. Trends Cardiovasc. Med. 10 (2), 60–65. doi: 10.1016 / s1050-1738 (00) 00048-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Pirinen, R., Tammi, R., Tammi, M., Hirvikoski, P., Parkkinen, J. J., Johansson, R., et al. (2001). Прогностическое значение экспрессии гиалуронана при немелкоклеточном раке легкого: повышенная экспрессия стромы указывает на неблагоприятный исход у пациентов с аденокарциномой. Внутр. J. Cancer 95 (1), 12–17. DOI: 10.1002 / 1097-0215 ​​(20010120) 95: 1 <12 :: AID-IJC1002> 3.0.CO; 2-E

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Proudfoot, A. E., Handel, T. M., Johnson, Z., Lau, E. K., LiWang, P., Clark-Lewis, I., et al. (2003). Связывание и олигомеризация гликозаминогликанов важны для активности in vivo некоторых хемокинов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 (4), 1885–1890. doi: 10.1073 / pnas.0334864100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Purushothaman, A., Сугахара, К., и Файсснер, А. (2012). «Мотивы колебания» хондроитинсульфата модулируют поддержание и дифференцировку нервных стволовых клеток и их потомков. J. Biol. Chem. 287 (5), 2935–2942. doi: 10.1074 / jbc.R111.298430

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Qiu, H., Jin, L., Chen, J., Shi, M., Shi, F., Wang, M., et al. (2020). Всесторонний гликомический анализ показывает, что гликирование человеческого сывороточного альбумина специфически влияет на фармакокинетику и эффективность различных антикоагулянтных препаратов при диабете. Диабет 69 (4), 760–770. doi: 10.2337 / db19-0738

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рагураман А., Мозье П. Д. и Десаи У. Р. (2010). Понимание взаимодействия дерматансульфат-кофактор гепарина II с помощью виртуального скрининга библиотеки. ACS Med. Chem. Lett. 1 (6), 281–285. doi: 10.1021 / ml100048y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Розенберг, Р. Д., и Дамус, П. С. (1973). Очистка и механизм действия кофактора антитромбин-гепарин человека. J. Biol. Chem. 248 (18), 6490–6505. DOI: 10.1016 / S0021-9258 (19) 43472-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сайто Т., Сугияма К., Хама С., Ямасаки Ф., Такаясу Т., Носака Р. и др. (2017). Высокая экспрессия глипикана-1 предсказывает диссеминацию и плохой прогноз при глиобластомах. World Neurosurg. 105, 282–288. doi: 10.1016 / j.wneu.2017.05.165

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Salbach, J., Rachner, T.D., Rauner, M., Hempel, U., Anderegg, U., Franz, S., et al. (2012). Регенеративный потенциал гликозаминогликанов для кожи и костей. J. Mol. Med. 90 (6), 625–635. doi: 10.1007 / s00109-011-0843-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сандовал, Д. Р., Гомес Толедо, А., Художник, К. Д., Тота, Э. М., Шейх, М. О., Уэст, А. М. В. и др. (2020). Скрининг эндотелиального гепарансульфатного интерактома на основе протеомики показывает, что лектин C-типа 14a (CLEC14A) является гепарин-связывающим белком. J. Biol. Chem. 295 (9), 2804–2821. doi: 10.1074 / jbc.RA119.011639

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шанкаранараянан, Н. В., Нагараджан, Б., и Десаи, У. Р. (2018). Так вы думаете, что вычислительные подходы к пониманию взаимодействия гликозаминогликанов с белками слишком сухие и слишком жесткие? Подумай еще раз! Curr. Opin. Struct. Биол. 50, 91–100. doi: 10.1016 / j.sbi.2017.12.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sankarayanarayanan, N.В., Штребель Т. Р., Бутелло Р. С., Ширин К., Рагураман А. и Саллас Ф. (2017). Гексасахарид, содержащий редкие остатки 2-O-сульфат-глюкуроновой кислоты, избирательно активирует кофактор гепарина II. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 56 (9), 2312–2317. doi: 10.1002 / anie.201609541

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schlachter, S., Seshu, J., Lin, T., Norris, S., and Parveena, N. (2018). Гликозаминогликан-связывающий белок bgp Borrelia burgdorferi в штамме B31 не является существенным для инфекционности, несмотря на то, что он способствует прилипанию и колонизации тканей. Заражение. Иммунная . doi: 10.1128 / IAI.00667-17

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schlessinger, J., Plotnikov, A. N., Ibrahimi, O.A., Eliseenkova, A. V., Yeh, B. K., Yayon, A., et al. (2000). Кристаллическая структура тройного комплекса FGF-FGFR-гепарин показывает двойную роль гепарина в связывании и димеризации FGFR. Мол. Ячейка 6 (3), 743–750. doi: 10.1016 / s1097-2765 (00) 00073-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмидтке, М., Каргер, А., Меербах, А., Эгерер, Р., Стельцнер, А., и Макаров, В. (2003). Связывание N, N’-бисгетерильного производного диспиротрипиперазина с остатками гепарансульфата на поверхности клетки, в частности, предотвращает инфицирование вирусов из разных семейств. Вирусология 311 (1), 134–143. DOI: 10.1016 / s0042-6822 (03) 00166-1

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шовальтер Р. М., Пастрана Д. В. и Бак К. Б. (2011). Гликозаминогликаны и сиалированные гликаны последовательно способствуют проникновению инфекции полиомавируса клеток Меркеля. PLoS Pathog. 7 (7), e1002161. doi: 10.1371 / journal.ppat.1002161

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schrevel, M., Osse, E.M., Prins, F.A., Trimbos, J., Fleuren, G.J., Gorter, A., et al. (2017). Аутокринная экспрессия рецептора эпидермального фактора роста, лиганда, гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста при раке шейки матки. Внутр. J. Oncol. 50 (6), 1947–1954. doi: 10.3892 / ijo.2017.3980

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schultz, V., Суфлита, М., Лю, X., Чжан, X., Ю, Ю., Ли, Л. и др. (2017). Домены гепарансульфата, необходимые для передачи сигналов факторам роста 1 и 2 фибробластов через рецептор 1c фактора роста фибробластов. J. Biol. Chem. 292 (6), 2495–2509. doi: 10.1074 / jbc.M116.761585

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сепуру, К. М., Нагараджан, Б., Десаи, У. Р. и Раджаратнам, К. (2018). Структурные основы, стехиометрия и термодинамика связывания хемокинов KC и MIP2 с гликозаминогликановым гепарином. J. Biol. Chem. 293 (46), 17817–17828. doi: 10.1074 / jbc.RA118.004866

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шарма Б., Хэндлер М., Эйхштеттер И., Уайтлок Дж. М., Ньюджент М. А. и Иоззо Р. В. (1998). Антисмысловое нацеливание на перлекан блокирует рост опухоли и ангиогенез in vivo . J. Clin. Инвестировать. 102 (8), 1599–1608. doi: 10.1172 / JCI3793

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ши, Дж., Fan, C., Zhuang, Y., Sun, J., Hou, X., Chen, B., et al. (2019). Гепарансульфат протеогликан способствует функции фактора роста фибробластов-2 при ишемическом восстановлении сердца. Biomater. Sci. 7 (12), 5438–5450. doi: 10.1039 / c9bm01336a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Shriver, Z., Capila, I., Venkataraman, G., and Sasisekharan, R. (2012). Гепарин и гепарансульфат: анализ структуры и микрогетерогенности. Handb. Exp. Pharmacol. 207, 159–176.doi: 10.1007 / 978-3-642-23056-1_8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Shute, J. K., Puxeddu, E., and Calzetta, L. (2018). Терапевтическое использование гепарина и его производных помимо антикоагулянтов у пациентов с бронхиальной астмой или ХОБЛ. Curr. Opin. Pharmacol. 40, 39–45. doi: 10.1016 / j.coph.2018.01.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Stopschinski, B.E., Holmes, B.B., Miller, G.M., Manon, V.A., Vaquer-Alicea, J., Prueitt, W. L., et al. (2018). Для поглощения клетками тау-белка по сравнению с агрегатами альфа-синуклеина и бета-амилоида требуются специфическая длина цепи гликозаминогликана и характер сульфатирования. J. Biol. Chem. 293 (27), 10826–10840. doi: 10.1074 / jbc.RA117.000378

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Stringer, S. E., and Gallagher, J. T. (1997). Специфическое связывание хемокинового фактора тромбоцитов 4 с гепарансульфатом. J. Biol. Chem. 272 (33), 20508–20514.doi: 10.1074 / jbc.272.33.20508

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sunseri, M., Ahuja, T., Wilcox, T., and Green, D. (2018). Приобретенная коагулопатия и кровотечение вследствие подкожной профилактики гепарином. Case Rep. Hematol. 2018, 9501863. doi: 10.1155 / 2018/9501863

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тай, Л. М., Томас, Р., Мароттоли, Ф. М., Костер, К. П., Канекиё, Т., Моррис, А. В. и др. (2016).Роль APOE в дисфункции сосудов головного мозга. Acta Neuropathol. 131 (5), 709–723. doi: 10.1007 / s00401-016-1547-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Tammi, R.H., Passi, A.G., Rilla, K., Karousou, E., Vigetti, D., Makkonen, K., et al. (2011). Транскрипционная и посттрансляционная регуляция синтеза гиалуронана. FEBS J. 278 (9), 1419–1428. doi: 10.1111 / j.1742-4658.2011.08070.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тандон, Р., Шарп, Дж. С., Чжан, Ф., Помин, В. Х., Эшпол, Н. М., Митра, Д. и др. (2020). Эффективное ингибирование проникновения SARS-CoV-2 производными гепарина и эноксапарина. bioRxiv [Epub перед печатью]. doi: 10.1101 / 2020.06.08.140236

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тейлор, К. Р., Галло, Р. Л. (2006). Гликозаминогликаны и их протеогликаны: связанные с хозяином молекулярные паттерны для инициации и модуляции воспаления. FASEB J. 20 (1), 9–22.doi: 10.1096 / fj.05-4682rev

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ten Dam, G. B., van de Westerlo, E. M., Purushothaman, A., Stan, R. V., Bulten, J., Sweep, F. C., et al. (2007). Антитело GD3G7, отобранное против эмбриональных гликозаминогликанов, определяет домены хондроитинсульфат-E, в высокой степени активируемые при раке яичников и участвующие в связывании фактора роста эндотелия сосудов. Am. J. Pathol. 171 (4), 1324–1333. doi: 10.2353 / ajpath.2007.070111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Tiwari, V., Tandon, R., Sankaranarayanan, N.V., Beer, J.C., Kohlmeir, E.K., Swanson-Mungerson, M., et al. (2020). Предпочтительное распознавание и антагонизм связывания гликопротеина SARS-CoV-2 с 3-O-сульфатированным гепарансульфатом. bioRxiv [Epub перед печатью]. doi: 10.1101 / 2020.10.08.331751

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тонг, В. и Ван, Г. (2018). Каким образом нативная масс-спектрометрия может способствовать характеристике биомакромолекулярной структуры и взаимодействий более высокого порядка? Методы 144, 3–13. doi: 10.1016 / j.ymeth.2018.04.025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цудзиока, Х., Йоцумото, Ф., Хикита, С., Уэда, Т., Куроки, М., и Миямото, С. (2011). Нацеленность на гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста, подобный фактору роста, в терапии рака яичников. Curr. Opin. Акушерство. Гинеколь. 23 (1), 24–30. doi: 10.1097 / GCO.0b013e3283409c91

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Vallet, S.Д., Клерк, О., Рикар-Блюм, С. (2021). Взаимодействия гликозаминогликанов с белками: первый вариант взаимодействия гликозаминогликанов. J. Histochem. Cytochem. 69 (2), 93–104. doi: 10.1369 / 0022155420946403

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вибуд, Г. И., и Блиска, Дж. Б. (2005). Наружные белки иерсиний: роль в модуляции сигнальных ответов и патогенеза клеток-хозяев. Annu. Rev. Microbiol. 59, 69–89. DOI: 10.1146 / annurev.micro.59.030804.121320

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Walenga, J. M., Jeske, W. P., Samama, M. M., Frapaise, F. X., Bick, R. L., and Fareed, J. (2002). Фондапаринукс: синтетический пентасахарид гепарина в качестве нового антитромботического средства. Мнение эксперта. Расследование. Лекарства 11 (3), 397–407. doi: 10.1517 / 13543784.11.3.397

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Warkentin, T. E. (2018). Гепарин-индуцированный тромбоцитопенический тромбоз: от артериальной до венозной и до венозной гангрены конечностей. J. Thromb. Гемост. 16 (11), 2128–2132. doi: 10.1111 / jth.14264

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wight, T. N., and Merrilees, M. J. (2004). Протеогликаны при атеросклерозе и рестенозе: ключевые роли версикана. Circ. Res. 94 (9), 1158–1167. doi: 10.1161 / 01.RES.0000126921.29919.51

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ямада, С., Сугахара, К. (2008). Возможное терапевтическое применение хондроитинсульфата / дерматансульфата. Curr. Drug Discov. Technol. 5 (4), 289–301. doi: 10.2174 / 157016308786733564

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Yang, B., Wu, Y.J., Zhu, M., Fan, S. B., Lin, J., Zhang, K., et al. (2012). Идентификация сшитых пептидов из сложных образцов. Nat. Методы 9 (9), 904–906. doi: 10.1038 / nmeth.2099

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг Дж. И Чи Л. (2017). Характеристика структурных мотивов взаимодействия гликозаминогликанов и белков. Carbohydr. Res. 452, 54–63. doi: 10.1016 / j.carres.2017.10.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг Ю., Ду Ю. и Калташов И. А. (2020). Полезность нативного РС для понимания механизма действия перепрофилированных терапевтических средств при COVID-19: гепарин как разрушитель взаимодействия SARS-CoV-2 с его рецептором клетки-хозяина. Анал. Chem. 92 (16), 10930–10934. doi: 10.1021 / acs.analchem.0c02449

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Yugandhar, K., Ван, Т. Ю., Вербовски, С. Д., Шайхидин, Э. Э., Ю Х. (2020). Валидация на основе структуры может резко занижать частоту ошибок в масс-спектрометрических исследованиях с перекрестным связыванием протеома. Nat. Методы 17 (10), 985–988. doi: 10.1038 / s41592-020-0959-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhou, J., Lin, J., Leung, W. T., and Wang, L. (2020). Базовое представление о мукополисахаридозе: заболеваемость, клинические особенности, диагностика и лечение. Неизлечимый редкий диск. Res. 9 (1), 1–9. doi: 10.5582 / irdr.2020.01011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zong, C., Venot, A., Li, X., Lu, W., Xiao, W., Wilkes, J. L., et al. (2017). Микроматрица гепарансульфата показывает, что связывание гепарансульфата с белком требует различных лигандов. J. Am. Chem. Soc. 139 (28), 9534–9543. doi: 10.1021 / jacs.7b01399

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рвотные движения | Что нужно знать о рвотном рефлексе

Инфекционные причины

Дыхательные пути чрезвычайно восприимчивы к инфекциям из-за их прямого контакта с окружающей средой.

• Вирус: Вирусные инфекции могут вызывать образование слизи в дыхательных путях, которая стекает по задней стенке глотки, вызывая рвоту. Простуда и грипп являются примерами вирусной инфекции, которая может быть связана с рвотой.
• Бактериальные: Бактериальные инфекции могут вызывать более серьезные заболевания верхних и нижних дыхательных путей, чем вирусные инфекции. Помимо рвоты или рвоты, бактериальные инфекции часто связаны с высокой температурой, ознобом, затрудненным дыханием и кровохарканьем.

Причины, связанные с окружающей средой

Так же, как бактерии могут легко попасть в верхние дыхательные пути, другие вещества из окружающей среды (намеренно или непреднамеренно) могут попасть в организм и вызвать рвоту.

• Упражнение: Выполнение упражнений с высокой интенсивностью может вызвать сокращение диафрагмы, что, в свою очередь, может вызвать рвоту. Особенно беспокоят упражнения на полный желудок, которые также могут вызвать рвоту.
• Лекарство: Тошнота, хотя и не до конца понятна, также может вызвать у вас рвотные движения.Некоторые лекарства, используемые для лечения тревожности, депрессии и других состояний, могут вызывать тошноту, а рвотные массы могут стать нежелательным побочным эффектом.

Механические причины

Причины, имеющие механический характер, могут включать следующее.

• Препятствие: Наличие структуры, блокирующей дыхательные пути, может вызвать рвоту, потому что ваше тело пытается устранить источник раздражения. Причиной этого часто бывает удушье от инородных тел, особенно у детей.
• Функциональный: Заболевания, которые ослабляют координацию дыхательных путей и мышц, используемых для глотания, могут затруднять вывод раздражающих веществ из вашего тела, что часто приводит к болезненной пощечинке и сухому вздутию.

Этот список не является медицинской консультацией и может неточно отражать то, что у вас есть.

Проглатывание инородного тела

Попадание внутрь непищевого объекта может иметь непредсказуемые и потенциально опасные последствия для организма.

Редкость: Редко

Основные симптомы: рвота, глубокая боль в груди, за грудиной, проблемы с глотанием, глотание чего-то потенциально опасного, рвотные движения

Симптомы, которые всегда возникают при проглатывании инородного тела: глотание что-то потенциально опасное

Симптомы, которые никогда не возникают при проглатывании инородного тела: удушье

Срочность: Личное посещение

Инсульт или тиа (транзиторная ишемическая атака)

Транзиторная ишемическая атака, или ТИА, иногда называется «мини-удар» или «предупреждающий удар».«Любой инсульт означает, что кровоток где-то в мозге был заблокирован сгустком.

Факторы риска включают курение, ожирение и сердечно-сосудистые заболевания, хотя любой может испытать ТИА.

Симптомы являются« временными », то есть они возникают и исчезнут в течение нескольких минут, потому что сгусток растворяется или движется сам по себе. Симптомы инсульта включают слабость, онемение и паралич одной стороны лица и / или тела; невнятную речь, нарушение зрения и внезапную сильную головную боль.

ТИА помогает не причинить непоправимого ущерба, потому что он быстро закончится.Однако пациенту необходимо пройти курс лечения, поскольку ТИА является предупреждением о вероятности более опасного инсульта. Отведите пациента в отделение неотложной помощи или позвоните по телефону 9-1-1.

Диагноз ставится на основании истории болезни пациента; физический осмотр; Компьютерная томография или МРТ; и электрокардиограмма.

Лечение включает прием антикоагулянтов для предотвращения образования тромбов. Также может быть рекомендована операция по очистке некоторых артерий.

Редкость: Часто

Основные симптомы: головокружение, онемение ног, онемение рук, новая головная боль, ригидность шеи

Симптомы, которые никогда не возникают при инсульте или тиа (транзиторной ишемической атаке): двусторонняя слабость

Срочно: Скорая медицинская помощь

Заглоточный абсцесс (взрослый)

Заглоточный абсцесс – скопление гноя в тканях задней части глотки.Это потенциально опасное для жизни заболевание.

Редкость: Ультра редко

Основные симптомы: боль в горле, потеря аппетита, лихорадка, одышка, тяжелое состояние

Срочно: Приемное отделение больницы

Кислотная рефлюксная болезнь (герд)

ГЭРБ (гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь) у младенцев означает попадание содержимого желудка в горло, вызывающее неприятные симптомы, такие как непереносимость кормления, недостаточное потребление калорий внутрь и / или плохой набор веса.Рвота или видимая регургитация …

Синдром Гийена-Барре

Синдром Гийена-Барре – это состояние, при котором иммунная система организма повреждает части нейронов. Синдром Гийена-Барре обычно возникает после инфекции или другого триггерного события. Считается, что это событие приводит к аномальному иммунному ответу, при котором организм ..

Воспаление надгортанника

Эпиглоттит – это воспаление надгортанника, ткани, покрывающей трахею (трахею), что помогает предотвратить кашель или удушье после глотания. .Обычно это вызвано бактериями H. Influenzae, но также может быть вызвано другими бактериями или вирусами, вызывающими инфекции верхних дыхательных путей.

Редкость: Редко

Основные симптомы: тяжелое заболевание, одышка, лихорадка, боль в горле, боль при глотании

Симптомы, которые никогда не возникают при воспалении надгортанника: кашель

Срочность: Скорая медицинская помощь

Боковой амиотрофический склероз (als)

Боковой амиотрофический склероз также называют БАС или болезнью Лу Герига, названной в честь бейсболиста Зала славы, карьера которого закончилась, когда у него развился БАС.Это дегенеративное заболевание, которое разрушает нервные клетки, которые в конечном итоге ..

Пользователи TikTok делятся трюком, чтобы «остановить рвотный рефлекс», и на самом деле они могут быть чем-то там

Еще одна неделя, еще одна медицинская история становится вирусной в TikTok. Вслед за грандиозным хитом «вот как ты накладываешь шину», люди на сайте делятся «уловкой», которая якобы останавливает рвотный рефлекс.

Нет необходимости становиться синим, это вполне возможно, потому что сейчас все проводят ужасное количество тестов на COVID-19, которые, если вы хоть немного похожи на нас, могут заставить вас ужасно заткнуть рот.

В одном видео, которое сейчас распространяется, пользователь gemmalawson57 демонстрирует эту технику, а закадровый голос объясняет ее.

–

«Хорошо, ребята, возьмите левую руку и сожмите большой палец в кулак», – говорит неизвестный голос. «Сожмите как можно сильнее, а через пять секунд возьмите указательный палец правой руки и прижмите его к подбородку. Теперь сосчитайте до пяти».

“Хорошо, теперь возьмите большой и указательный пальцы правой руки и сожмите кожу между большим и указательным пальцами левой руки.Сожмите его на пять секунд. Хорошо, теперь ты избавился от рвотных рефлексов, спасибо позже. “

Это ни в коем случае не первый раз, когда “хакер” был опубликован на сайте, когда другие проделывали аналогичные трюки еще в 2020 году.

–

–

–

Итак, в этом есть что-нибудь? Что ж, на самом деле это выглядит позитивно – хотя некоторые из шагов, которые делают TikTokers, являются странными и ненужными дополнениями, и они могут сделать, переместившись в немного другое место, чтобы оказать давление.

Этому вопросу посвящено несколько исследований. Стоматологи особенно заинтересованы в остановке рвотного рефлекса, учитывая, что их работа требует, чтобы они находились в так называемой «зоне извержения». Во-первых, исследование, опубликованное в Журнале Американской стоматологической ассоциации, показало, что небольшая группа добровольцев оказывала давление на ладони до того, как они получили стоматологическое лечение.

«Тридцать шесть неврологически здоровых субъектов прошли серию испытаний рвотного рефлекса (исходный уровень, фиктивный и лечебный)», – написала команда в статье.«Авторы разработали устройство для надавливания на руки для ношения испытуемых, которое обеспечивает постоянную силу, и они описали шкалу индекса триггерной точки рвоты (GTPI). На основе GTPI они разделили испытуемых на сверхчувствительную группу и ожидаемую – чувствительная (контрольная) группа ».

Они обнаружили, что при надавливании на ладонь рвотный рефлекс сдвигался назад, дальше в рот пациента – если пациент давился чем-то не очень далеко во рту, точка, в которой он начинал давиться, была бы дальше назад. после того, как было приложено давление.Они пришли к выводу, что «применение точки давления во время стоматологических процедур снизит вероятность срабатывания рвотного рефлекса», хотя они подчеркнули, что необходимы дополнительные исследования.

Отвлечение – это эффективный метод ослабления рвотного рефлекса, так что могло случиться так, что это произошло, или что в игре был эффект плацебо.

Однако другие пытались объяснить это, оказывая давление на несколько регионов по ряду вопросов. Опубликованное в Национальном центре биотехнической информации исследование оказало давление на «акупунктурную точку P-6 Neikuan, расположенную на запястье, которая использовалась на Дальнем Востоке в течение тысяч лет из-за ее свойств против тошноты и снятия тревоги»

Они также давили на фиктивные участки.

«Точка P-6 обладает замечательным эффектом против рвоты, если стимуляция применяется правильно», – заключили они. «Клиницисты могут надавливать большим пальцем на точку P-6 для достижения некоторого эффекта, хотя это не так эффективно, как иглоукалывание. Тем не менее, значительный процент пациентов, у которых есть рвота, смогут пройти стоматологические процедуры без рвоты, когда точка P-6 стимулируется “.

Однако давление оказывается на запястье.

Еще одно исследование рассматривало лазерную стимуляцию (как альтернативу иглоукалыванию) на точку над подбородком, также отмеченную в вирусных видеороликах выше.Опять же, у пациентов наблюдалось значительное снижение рвотного рефлекса по сравнению с плацебо. К сожалению, мы не знаем, почему, хотя у них есть теории.

«Механизм действия по контролю рвотного рефлекса с помощью иглоукалывания полностью не изучен. Он охватывает спектр рвотного рефлекса от легкого конца тошноты до тяжелого конца, который достигает кульминации в рвоте», – пишут исследователи в опубликованной статье. в природе.

«Было показано, что иглоукалывание ускоряет синтез [серотонина] 5-HT, и вполне вероятно, что механизм серотонина принимает участие в контроле рвотного рефлекса.«

В заключение: TikTok, вы, вероятно, наткнулись на что-то на этом, но вы, вероятно, можете перестать зажимать кожу между большим и указательным пальцами и вместо этого надавить на свое запястье в месте P6. Вероятно, здесь присутствует и эффект плацебо, но кого волнует, остановит ли он вас рвоту во время тестов на Covid.

---

НА ЭТОЙ НЕДЕЛЕ IFLSCIENCE

Еженедельно получайте наши крупнейшие научные новости на свой почтовый ящик!

---

Гликозаминогликаны – потенциальная причина ревматоидного артрита

Реферат

Ревматоидный артрит (РА) – хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани неизвестной этиологии.Мы исследовали, вызывают ли аберрантные иммунные ответы на гликозаминогликаны (ГАГ), основной компонент суставного хряща, суставной жидкости и других мягких соединительных тканей, это заболевание. Здесь мы показываем, что инъекции ГАГ, таких как гиалуроновая кислота, гепарин и хондроитинсульфаты A, B и C, вызывают артрит, тендосиновит, дерматит и другие патологические состояния у мышей. Мы разработали методику окрашивания образцов тканей ГАГ, меченных флуорохромом или биотином, для визуализации прямого связывания между клетками и ГАГ.Мы обнаружили, что в воспалительных инфильтратах пораженной ткани преобладает особый фенотип GAG-связывающих клеток, значительную часть которых составляют Т-клетки CD4 ⁺ . GAG-связывающие клетки, по-видимому, размножаются в костном мозге GAG-иммунизированных мышей. Кроме того, мы идентифицировали GAG-связывающие клетки в воспаленной синовиальной ткани пациентов с РА. Наши результаты предполагают, что углеводные аутоантигенные ГАГ вызывают аутоиммунные дисфункции, которые включают экспансию ГАГ-связывающих клеток, которые мигрируют в анатомические участки, богатые ГАГ.Эти связывающие GAG клетки могут, в свою очередь, способствовать воспалению и патологии, наблюдаемым как в нашей мышиной модели, так и в RA человека.

Аутоиммунные заболевания соединительной ткани, группа различных заболеваний неизвестной этиологии, включают ревматоидный артрит (РА), системную красную волчанку, прогрессирующий системный склероз или системную склеродермию, полимиозит, дерматомиозит и синдром Шегрена (1–3). У них общие общие, частично совпадающие клинические, лабораторные и патологические особенности, особенно на ранних стадиях, что часто затрудняет их классификацию и диагностику (1–3).Наиболее распространенным заболеванием этой группы является РА, хроническое воспалительное заболевание, которое поражает в первую очередь суставы, но может распространяться на соединительную ткань по всему телу (1–3). Эти состояния затрагивают людей всех возрастов и часто вызывают инвалидность и хронические нарушения (2). Несмотря на важные достижения в понимании многих патогенетических аспектов, этиология аутоиммунных заболеваний соединительной ткани остается давней медицинской загадкой.

Соединительная ткань состоит из тонких слоев клеток, разделенных внеклеточными матрицами, которые содержат в основном протеогликаны, состоящие из гликозаминогликанов (ГАГ), ковалентно связанных с тканеспецифическими коровыми белками (4, 5).ГАГ включают гиалуроновую кислоту (HA), хондроитинсульфат A (CSA), B (CSB) и C (CSC), гепарин (HP), гепарансульфат и кератансульфат (4). Они представляют собой семейство высокоанионных полисахаридов с аналогичными повторяющимися дисахаридными единицами уроновой кислоты и гексозамина (4). Изменения в уровнях или молекулярной природе ГАГ ранее были связаны с некоторыми заболеваниями соединительной ткани. Например, пациенты с РА и склеродермией имеют повышенные концентрации ГАГ в крови и синовиальной жидкости, а разрушение пораженных суставов у пациентов с РА положительно коррелирует с высокими уровнями ГАГ в синовиальной жидкости (5-7).Несмотря на эти данные, аберрантные иммунные ответы на ГАГ не рассматривались как возможная причина РА или других родственных заболеваний.

Углеводы обычно считаются инертными или слабыми иммуногенами, которые не вызывают клеточных и зрелых гуморальных ответов. Такое восприятие могло помешать исследованию ГАГ как возможных антигенов, связанных с аутоиммунными заболеваниями. Однако хорошо известно, что богатые GAG внеклеточные матрицы являются резервуарами для факторов роста и других агентов, которые контролируют поведение клеток, и что GAG взаимодействуют с различными белками и регулируют развитие, адгезию, дифференцировку и пролиферацию клеток (8-12).Учитывая разнообразную биологическую активность ГАГ, их тесную связь с РА и родственными заболеваниями, а также обилие ГАГ в соединительной ткани, мы предположили, что аберрантный иммунный ответ на ГАГ может играть роль в заболеваниях соединительной ткани. Здесь мы показываем, что введение ГАГ вызывает аутоиммунное заболевание соединительной ткани у мышей, и исследуем его значение для РА у человека.

Материалы и методы

Материалы.

HA, HP, CSA, CSB и CSC были приобретены у Sigma-Aldrich и очищены расщеплением ДНКазой I, РНКазой A и протеиназой K (Worthington) и фракционированием на колонке Superdex 200 (Amersham Pharmacia).Средние молекулярные массы HA, HP, CSA, CSB и CSC составляли 1100, 59, 114, 100 и 970 кДа соответственно. ГАГ не содержали белка и нуклеиновых кислот, что подтверждено спектроскопией ЯМР ^-1, H при 500 МГц, сканированием в УФ-видимом диапазоне от 190 до 300 нм и анализом белка Брэдфорда (13). Меченые флуоресцеином ГАГ получали, как описано (14). Для получения меченных биотином ГАГ 10 мг ГАГ, растворенного в 0,2 мл 0,1 М Mes буфера (pH 5), смешивали с 0,3 мл 50 мМ гидразида биотина и 10 мг 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида. гидрохлорид (Sigma-Aldrich).Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч, а затем обессоливали на колонке PD-10 (Amersham Pharmacia). Полученные продукты ГАГ-биотин были структурно подтверждены спектроскопией ЯМР ^-1 Н.

Модель мыши.

Группам из 8–12 самок мышей BALB / c (The Jackson Laboratory) в возрасте 6–8 недель внутрикожно в основание хвоста вводили 100 мкг ГАГ, растворенных в 25 мкл PBS (50 мМ фосфата / 0,15 М NaCl, pH 7,2) и смешивали с равным объемом 5% адъюванта Al (OH) ₃ (Superfos Biosector, Frederikssund, Дания).Контрольные мыши получали только PBS и Al (OH) ₃ . Инъекции делали на 1, 16, 43, 80 и 100 дни соответственно. Сыворотку мышей получали на -1, 8, 15, 37, 75 и 118 дни. Мышей обследовали через день на предмет эритемы и отека лап. Симптомы оценивались по шкале от 0 до 3 для всех четырех лап в зависимости от тяжести эритемы и отека. Оценка 0 указала на отсутствие признаков эритемы и припухлости лапы, 1 балл указывал на эритему и легкую припухлость, 2 указывал на эритему и явный отек, а 3 указывал на эритему и сильный отек лапы.Во избежание двусмысленности мы считали мышь больной, если хотя бы одна лапа у нее была оценена как 2 или выше. В различные моменты времени мышей из каждой группы умерщвляли для проведения гистологического анализа. Мышей фиксировали фиксатором Буэна, их кости декальцинировали, образцы заливали парафином, а тонкие срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

GAG-флуоресцентное окрашивание.

Залитые парафином срезы ткани дважды погружали на 10 мин в ксилол, дважды на 3 мин в 100% этанол и трижды на 5 мин в PBS.Срезы блокировали PBS, содержащим 1% BSA и 5% FCS (Life Technologies, Grand Island, NY), в течение 1 часа при 25 ° C. Каждое слайд инкубировали со 100 мкл 0,5 мг · мл ^-1 меченой флуоресцеином HA (5 мол.% Флуоресцеина) или меченым биотином HP, CSA, CSB или CSC (5-10 мол.% Биотина) при 25 ° C. ° C в течение 2 ч. Слайды, инкубированные с биотин-GAG, обрабатывали 100 мкл 0,1 мг / мл ^-1 Alexa Fluor 568-меченного стрептавидина (молекулярные зонды) при 25 ° C в течение 3 часов. Для экспериментов по оценке стоимости срезы тканей сначала инкубировали со 100 мкл 0.1 мг⋅мл ^-1 меченные биотином крысиные антитела против CD4 или CD44 мыши (Southern Biotechnology Associates) при 4 ° C в течение ночи, а затем со 100 мкл 0,1 мг⋅ мл ^-1 смесь стрептавидина, меченного Alexa Fluor 568 с 0,5 мг⋅мл ^-1 НА-флуоресцеина при 25 ° C в течение 3 часов.

Количественное определение антител.

Концентрации сывороточных антител против ГАГ у иммунизированных мышей определяли количественным ИФА (15). 96-луночные планшеты EIA / RIA (Corning) покрывали 100 мкл 50 мкг / мл ^-1 GAG в 0.Буфер 1 M NaHCO ₃ (pH 8,6) при 4 ° C в течение 16 часов. Планшеты трижды промывали PBS + (50 мМ фосфат / 0,15 M NaCl / 1 мМ CaCl ₂ /1 мМ MgCl ₂ / 0,05% Brij 35, pH 7,4) и затем блокировали 5% FCS в PBS + при 25 ° C. ° C в течение 2 ч. Сыворотку мышей, разведенную 1:50 в инкубационном буфере (PBS +, 1% BSA, pH 7,4), добавляли в лунки в двух экземплярах и инкубировали при 25 ° C в течение 2 часов. Затем планшеты промывали и инкубировали с 0,5 мкг · мл ^-1 меченных щелочной фосфатазой козьих антимышиных IgM или IgG (Southern Biotechnology Associates) в инкубационном буфере при 25 ° C в течение 2 часов.Планшеты проявляли с 1 мг / мл ^-1 p -нитрофенилфосфата в 1 М Трис с 0,3 мМ MgCl ₂ (pH 9,8) при 25 ° C. Концентрации антител против ГАГ определяли путем сравнения оптических плотностей тестовых сывороток при 405 нм со стандартами, разработанными на том же планшете, с использованием известных концентраций очищенных мышиных IgM или IgG.

Анализ пролиферации клеток.

Анализ клеток

проводили в 96-луночных планшетах для культивирования клеток (Corning).Суспензии спленоцитов мыши готовили из свежеудаленных селезенок мыши, а эритроциты истощали лизирующим буфером ACK (0,15 М NH ₄ Cl / 10 мМ KHCO ₃ / 0,1 мМ Na ₂ EDTA, pH 7,2). Часть спленоцитов фракционировали на колонке из нейлоновой ваты для получения субпопуляций, обогащенных В- и Т-клетками (16, 17). Спленоциты (2,6 × 10 ⁶ мл ^-1 ) и фракции, обогащенные В-клетками (1,8 × 10 ⁶ мл ^-1 ), культивировали с 20 мкг / мл ^-1 CSA, CSB, CSC. , HP или HA в среде RPMI 1640 (Invitrogen) с добавлением 10% FCS (RPMI 1640–10).Фракции, обогащенные Т-клетками (2,2 × 10 ⁶ мл ^-1 ), культивировали с облученными спленоцитами (1,1 × 10 ⁶ мл ^-1 ) в качестве антигенпрезентирующих клеток и 20 мкг / мл ^-1 ГАГ в среде RPMI 1640–10. Для получения более конкретных типов клеток спленоциты были разделены с помощью магнита BD Imag антимышиных CD4 или CD45R / B220 (BD Biosciences, Сан-Диего) на четыре фракции: CD4 ⁺ , CD4 ^– , B220 ⁺ , и B220 ^– .Каждую фракцию (2–3 × 10 ⁶ мл ^–1 ) культивировали с индивидуальными ГАГ в среде RPMI 1640–10. Con A и липополисахарид из Escherichia coli (Sigma-Aldrich) использовали в качестве положительного контроля, а сама среда RPMI 1640-10 служила в качестве отрицательного контроля. Все клетки культивировали 4–9 дней. Клеточную пролиферацию измеряли по включению 5-бром-2′-дезоксиуридина (BrdUrd) в ДНК в течение последних 16 часов культивирования и определяли с помощью меченного щелочной фосфатазой антитела против BrdUrd с помощью ELISA.Клетки контролировали на экспрессию CD4 и CD44 с помощью анализа клеточного сортировщика, активируемого флуоресценцией.

Результаты

Модель животного.

Для изучения последствий иммунизации GAG мы разработали модель мыши, которая включала инъекцию GAG мышей BALB / c с адъювантом Al (OH) или без него. ₃ . Мы тестировали CSA, CSB, CSC, HP и HA, смешанные с Al (OH) ₃ , а также только CSC без адъюванта. Каждой мыши сделали пять инъекций.После второй инъекции у мышей начали проявлять симптомы в лапах на 31 день. Все ГАГ вызывали симптомы опухших лап, отека и эритемы лап и ушей (рис. 1). Были затронуты как передние, так и задние лапы, и у некоторых больных мышей была очевидна потеря шерсти на лапах. Симптомы менялись. Симптомы у мышей проявлялись в течение нескольких дней, выздоравливали в течение нескольких дней, а затем снова заболели. В целом мыши, получавшие ГАГ, становились хронически больными, у них в течение нескольких месяцев появлялись и исчезали симптомы (рис.1). Частота и тяжесть заболевания со временем увеличивались. Обострение и ремиссия симптомов напоминают течение РА у человека (1–3). Средний процент мышей, которые болели в день (распространенность), был наибольшим с CSB (37,2%), за которым следовали HP (36,2%), HA (32,8%), CSC (26,3%), CSC * (17,2%, без адъювант), CSA (12,8%) и контрольный PBS / адъювант (1,1%).

Рис 1.

( A ) Примеры опухшей, эритематозной задней лапы у мыши, получавшей CSC ( Top ), и нормальной задней лапы у контрольной мыши PBS ( Bottom ), обе на 60-й день эксперимента.Обратите внимание на вовлечение суставов предплюсны, плюсны и фаланга. ( B ) Динамика распространенности заболевания у мышей, получавших GAG или PBS в качестве контроля. CSC * обозначает лечение CSC без адъюванта Al (OH) ₃ . Ординаты варьируются от 0 до 100% для каждого графика. Числа справа от каждого графика представляют средний процент заболевших мышей в день. Обратите внимание на неустойчивый характер прогрессирования заболевания.

Гистопатология.

Больные мыши, получавшие разные ГАГ, показали очень похожие патологические изменения, включая синовиальные и s.c. отек, гиперплазия и гипертрофия клеток синовиальной оболочки, закупорка и расширение сосудов, а также клеточные инфильтраты в различных соединительных тканях (рис. 2). Нормальные оболочки синовиальной оболочки или сухожилия состоят из тонкого слоя синовиоцитов, выстилающих полость сустава и лежащих на соединительной ткани и жире (3). Синовиальная оболочка больных мышей гиперпластична и утолщена инфильтрирующими лимфоцитами и макрофагами (рис. 2). Аномально большое количество клеток инфильтрировало синовиальные оболочки и оболочки сухожилий различных дистальных суставов лап, таких как запястные / предплюсневые суставы и пястные / плюсневые / фаланговые суставы.Через 4 месяца у нескольких больных мышей была очевидна эрозия эпифизарной кости (рис. 2).

Рис 2.

( A ) Сагиттальный разрез пястной кости, демонстрирующий глобальную синовиальную гиперплазию и гипертрофию (примеры очагов указаны стрелками), выраженный периартрит и тендосиновит. Дистальный радиус справа; дорсальные волосяные фолликулы по верхнему краю. ( B ) Гиперпластическая и гипертрофическая (эозинофильная) синовиальная оболочка с инфильтрацией лимфоплазмоцитарных клеток (увеличение от A рядом с верхней правой стрелкой).( C ) Гиперпластическая и гипертрофическая синовия на тыльной стороне голеностопного сустава. Большеберцовая кость и пяточная кость у верхнего и правого краев соответственно. ( D ) Выраженный дорсальный периартрит около таранно-пяточного и поперечного суставов предплюсны. Таранная и пяточная кость по нижнему правому и верхнему краям соответственно. ( E ) Клеточная инфильтрация около дистального эпифиза большеберцовой кости с вовлечением влагалища сухожилия разгибателя. Начинается паннусоподобная эпифизарная эрозия кости с вовлечением многоядерных гигантских клеток (наконечник стрелки).( F ) Расширенное паннусоподобное остео- и хондролитическое поражение в дистальном отделе большеберцовой кости (стрелки), вовлекающее многочисленные многоядерные гигантские клетки. Полость костного мозга в правом верхнем углу. ( G ) Тяжелый перитендинит разгибателя большеберцовой кости. ( H ) Перитендинит и инфильтрация дермальными клетками около дистального межфалангового сустава. Ладонный эпидермис слева. ( I ) Маркировка н.в. отек и дерматит дистально в задней лапе. ( Вставка ) Увеличение области (стрелка) с инфильтрацией лимфоплазмоцитарных клеток дермы и паракератозом. A и B , C и I и D – H относятся к группам CSC *, HA и CSC соответственно. Мыши из других групп GAG демонстрируют аналогичную гистопатологию.

Помимо синовита и тендосиновита, ГАГ также вызывают дерматит. Дерма в дистальных отделах конечностей была инфильтрирована значительным количеством воспалительных клеток, преимущественно лимфоцитов (рис. 2). Обычно наблюдались утолщение эпидермиса и паракератоз.Однако кожа над местом укола в хвостах выглядела нормальной. Макро- и гистопатологическое исследование крупных внутренних органов, таких как легкие, печень, сердце, почки и мозг, не выявило никаких отклонений. Увеличенные гиперпластические подколенные лимфатические узлы были обнаружены у нескольких больных мышей (рис. 3). Общий дефицит нейтрофилов позволяет предположить, что воспалительная реакция не была вызвана острыми инфекционными процессами. В целом патологические изменения, которые мы наблюдали у больных мышей, иммунизированных GAG (например,g., синовит, тендосиновит и дерматит) часто наблюдаются у людей с РА и некоторыми другими заболеваниями соединительной ткани (1, 3).

Рис 3. Окрашивание

GAG тканей мышей, получавших GAG, демонстрирующее HA-связывающие клетки. ( A ) Инфильтрация кожных GAG-связывающих клеток вблизи дистального межфалангового сустава. Обратите внимание на эпидермис (вверху слева) и сухожилие сгибателя (внизу). ( B ) GAG-связывающие клетки в гиперпластической синовиальной оболочке. ( C ) Нехватка GAG-связывающих клеток в активированном подколенном лимфатическом узле.( D ) Инфильтрация соединительной ткани и оболочки сухожилия в разгибательном отделе возле таранно-пяточного сустава. Т, сухожилие; V, вена. ( E ) GAG-связывающие клетки в проксимальном эпифизарном костном мозге большеберцовой кости.

Аутоантитела.

Чтобы проверить, развиваются ли у этих мышей аутоантитела против GAG, мы измерили сывороточные уровни GAG-специфических IgM и IgG с помощью ELISA. У мышей, получавших ГАГ, средняя концентрация IgM составляла 0.19 мкг · мл ^-1 , но гораздо более низкие уровни IgG (<1 нг · мл ^-1 ). Однако у контрольных мышей также были обнаружены лишь немного меньшие количества GAG-специфических антител IgM. Кроме того, сыворотки из разных групп перекрестно реагировали с другими ГАГ. В целом, GAG индуцировали ответ антител с преобладанием IgM и не индуцировали переключение изотипа антител с IgM на IgG даже после пяти доз иммунизации GAG. Эти результаты показывают, что гуморальный ответ на ГАГ типичен для полисахаридных антигенов, которые индуцируют антитела посредством независимого от Т-клеток механизма (18).Однако мы не наблюдали последовательного ответа GAG-специфических антител, который коррелировал бы с наиболее сильными вызывающими заболевание антигенами GAG в нашей модели мыши. Более того, хотя тяжесть заболевания со временем увеличивалась, уровни GAG-специфических антител существенно не менялись.

Мы также исследовали ревматоидный фактор, то есть аутоантитела, распознающие Fc-часть IgG (19). Хотя его роль в патогенезе РА до конца не изучена, и у многих здоровых людей также экспрессируется ревматоидный фактор, у большинства пациентов с РА наблюдается повышенный уровень ревматоидного фактора (19).Мы тестировали сыворотки всех групп мышей с помощью ELISA, используя планшеты, покрытые мышиным IgG. Мы обнаружили только очень небольшие количества IgG-связывающего IgM (<6 нг · мл ^-1 ), и количество ревматоидного фактора в сыворотке мышей, обработанных GAG, существенно не отличалось от такового у контрольных мышей.

Cellular Effects.

ГАГ проявляют комплексную биологическую активность по отношению к различным клеткам, включая лимфоциты, моноциты, дендритные и стромальные клетки (10, 17, 20–23).Мы изучили клеточные реакции на ГАГ, чтобы определить корреляцию с развитием заболевания у мышей. Мы культивировали нефракционированные и фракционированные спленоциты мыши ex vivo с чистыми CSA, CSB, CSC, HP и HA. При 20 мкг · мл ^-1 CSB увеличивал пролиферацию спленоцитов в 3,17 раза по сравнению с контролем через 6 дней культивирования. HP, CSA, HA и CSC увеличивали пролиферацию спленоцитов в 1,60, 1,46, 1,14 и 1,12 раза соответственно. В случае спленоцитов, обогащенных В-клетками, пролиферативная активность следовала порядку CSB, HP, CSA, CSC и HA (от наибольшего к наименьшему).Спленоциты, обогащенные Т-клетками, культивировали как с ГАГ, так и с облученными спленоцитами. Пролиферативная активность следовала порядку CSB, HP, HA, CSC и CSA (от наибольшего к наименьшему). Анализы на изолированных спленоцитах CD4 ⁺ , CD4 ^– , B220 ⁺ и B220 ^– показали, что ГАГ стимулируют спленоциты, истощенные по B220, которые в основном включают Т-лимфоциты и моноциты. Эти результаты и дальнейшие анализы клеточного сортировщика с активацией флуоресценции (данные не показаны) показывают, что ГАГ по-разному активируют репликацию различных типов клеток сложным образом.CSB является наиболее активным GAG во всех анализах клеточной пролиферации, а также в индукции заболевания у мышей (рис. 1). Более того, порядок пролиферативной активности ГАГ на спленоцитах, обогащенных Т-клетками, положительно коррелирует с распространенностью заболевания (CSB> HP> HA> CSC> CSA; рис. 1). Эти данные предполагают, что ответ, опосредованный Т-клетками, может быть вовлечен в развитие заболевания у GAG-иммунизированных мышей.

Связывание GAG как особый фенотип инфильтрирующих клеток.

Поскольку воспалительные клетки преимущественно накапливаются в соединительной ткани, где много ГАГ, мы предположили, что эти клетки экспрессируют высокоаффинные и / или большие количества ГАГ-связывающих рецепторов. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разработали метод окрашивания тонких срезов фиксированной ткани мыши с меченными флуоресцеином или биотином ГАГ. Поразительно, но подавляющее большинство инфильтрирующих клеток в оболочках сухожилий, синовиальных оболочках и подкожных клетках. пробелы связывают HA (рис. 3).Флуоресцентное окрашивание с использованием меченых биотином HP или хондроитинсульфатов и стрептавидина, меченного флуорохромом, подтвердило, что инфильтрирующие клетки также связывают эти ГАГ.

Поскольку CD44 является повсеместным рецептором для HA и других GAG (24, 25), мы проверили, экспрессируется ли CD44 на инфильтрирующих клетках, с помощью иммунофлуоресцентного анализа с анти-CD44 и HA, меченным флуоресцеином. Значительная часть наблюдаемых клеток была CD44 ⁺ и также связывала НА (данные не показаны). Антитела к CD44 не снижали и не блокировали связывание HA с большинством инфильтрирующих клеток, что позволяет предположить, что инфильтрирующие клетки могут быть довольно гетерогенными или что эти клетки экспрессируют несколько рецепторов для GAG.Тем не менее, анализ клеточного сортировщика с активацией флуоресценции показал, что культивируемые CSB, HP и HA спленоциты мыши экспрессируют больше CD44, чем клетки, культивируемые без GAG (данные не показаны). Эти результаты показывают, что GAG могут активировать CD44, который, в свою очередь, может участвовать в развитии GAG-индуцированного заболевания, наблюдаемого у мышей.

Проникающие CD4

⁺ Т-клетки связывают ГАГ. Считается, что

Т-клетки играют решающую роль во многих аутоиммунных заболеваниях.Например, CD4 ⁺ Т-клетки являются крупнейшей субпопуляцией мононуклеарных клеток и вносят большую часть лимфоцитов в синовиальную ткань при РА и других аутоиммунных заболеваниях человека (26–29). Чтобы идентифицировать CD4 ⁺ Т-клетки у больных мышей, мы окрашивали срезы их лап крысиными антителами против CD4, меченными биотином, и стрептавидином, меченным флуоресцеином. Действительно, большие части клеток инфильтратируются в синовиальные оболочки, оболочки сухожилий и п / к. пробелами были CD4 ⁺ Т-клетки.Затем мы исследовали, связывают ли инфильтрирующие CD4 ⁺ Т-клетки также GAG. Мы обработали срезы тканей с меченными биотином антителами к CD4 плюс меченным Alexa Fluor 568 стрептавидином и HA-флуоресцеином. Анализ показал, что инфильтрирующие клетки CD4 ⁺ действительно связывают НА (фиг. 4). Чтобы проверить, связывает ли HA CD4 напрямую, мы заблокировали срезы моноклональными антителами к CD4, а затем окрашивали HA-флуоресцеином. Антитела к CD4 не ингибировали связывание НА с клетками CD4.Эти данные показывают, что HA может связываться с другими рецепторами на поверхности Т-клеток или, по крайней мере, что сайты связывания на CD4 различны.

Рис 4.

Иммуноокрашивание, показывающее GAG-связывающие CD4 ⁺ Т-клетки. CD4 ⁺ Т-клетки – красные, HA-связывающие клетки – зеленые, а расцветка – желтая.

Расширение GAG-связывающих клеток в костном мозге.

Хотя было получено много информации о лимфоцитах, накопленных в суставной ткани, практически ничего не известно о событиях, предшествующих их поступлению из кровотока.Гистологически костный мозг нескольких больных мышей казался гиперпластичным. Мы исследовали образцы костного мозга путем окрашивания HA-флуоресцеином. Неожиданно было обнаружено большое количество GAG-связывающих клеток в костном мозге (рис. 3). Часть этих GAG-связывающих клеток костного мозга представляет собой CD4 ⁺ Т-клетки (данные не показаны). Мы также исследовали костный мозг контрольных мышей, но обнаружили лишь очень небольшое количество HA-связывающих клеток. Хотя у нескольких больных мышей были сильно увеличены лимфатические узлы, очень мало GAG-связывающих клеток перемещалось внутрь (рис.3). Следовательно, разрастания аутореактивных GAG-связывающих клеток в лимфатических узлах не происходило. Предыдущие результаты также показывают, что инфильтрирующие Т-клетки не расширяются локально в суставах пациентов с артритом (26, 27). Цитокины Т-клеток, особенно цитокины Th3, почти полностью отсутствуют в ревматическом суставе человека, а цитокины Th2, по-видимому, производятся только на низких уровнях по сравнению с таковыми при других заболеваниях хронического воспаления (27). Таким образом, наше открытие, что GAG-связывающие клетки увеличиваются в костном мозге, может помочь прояснить парадокс происхождения Т и других воспалительных клеток, которые мигрируют в суставы.

GAG-связывающих клеток у пациентов с РА.

Чтобы исследовать актуальность GAG и GAG-связывающих клеток у людей с РА, мы окрашивали образцы хирургических тканей нескольких пациентов с HA, HP и CSB, меченными флуоресцеином или биотином. Мы наблюдали, что значительное количество инфильтрирующих клеток связывают ГАГ у пациентов с РА (рис. 5). Нормальная синовиальная или травмо-артротическая ткань не показывала связывания GAG (данные не показаны). Анализ CD4 показал, что значительная часть, но не все GAG-связывающие клетки, являются CD4 ⁺ Т-клетками (рис.5). Эти данные демонстрируют, что инфильтрирующие клетки в образцах от пациентов с РА проявляют GAG-связывающие свойства, очень похожие на патологические ткани мышей, иммунизированных GAG.

Рис 5.

Образец синовиальной ткани левого колена от 33-летней пациентки с РА. ( A ) Воспаленная и гиперпластическая синовиальная оболочка с лимфоплазмоцитарной инфильтрацией (окрашивание гематоксилином и эозином). ( B ) Окрашивание GAG показывает инфильтраты HA-связывающих клеток (соседний участок от A ).( C и D ) Стоимость HA-связывающих CD4 ⁺ Т-клеток. CD4 ⁺ Т-клетки – красные, HA-связывающие клетки – зеленые, а расцветка – желтая.

Обсуждение

Многие факторы способствуют повышению уровня ГАГ. ГАГ чрезмерно присутствуют в соединительной ткани и синовиальной жидкости. Воспаление, инфекция или физическое повреждение могут привести к высвобождению растворимых ГАГ. Воспалительная реакция, независимо от ее причины, сопровождается повышенным синтезом ГК в интерстиции (30).ГАГ секретируются при активации различных клеток, например эндотелиальных и Т-клеток (30, 31). Кроме того, бактериальные патогены отображают на своей поверхности ГАГ или ГАГ-подобные полисахаридные антигены, например, стрептококки группы А обладают капсулой, богатой НА (32). Микроорганизмы также секретируют ферменты, такие как гиалуронидаза, для высвобождения ГАГ из соединительной ткани (33, 34). Хотя многие инфекционные агенты могут вызывать воспалительный артрит, фактическим антигеном аутоиммунитета могут быть ГАГ.Основываясь на наших выводах, мы предлагаем далее патогенетическую модель роли ГАГ в заболеваниях соединительной ткани. Циркулирующие или локально высвобождаемые ГАГ вызывают клональную экспансию различных ГАГ-связывающих клеток, например Т- и В-клеток и макрофагов. Эти клетки из-за их усиленного или «созревшего» связывания с ГАГ преимущественно мигрируют и прикрепляются к соединительной ткани, где ГАГ в изобилии. ГАГ, экспрессируемые на клетках эндотелия и синовиальной оболочки, способствуют экстравазации и прикреплению ГАГ-связывающих клеток из кровотока в богатую ГАГ среду, такую ​​как соединительная ткань и хрящ.Чрезмерное и продолжительное накопление этих аномальных клеток в конечном итоге приводит к патологическим симптомам, включая повреждение суставного хряща и эрозию костей.

Обычно мы не генерируем иммунные ответы против наших собственных тканей, хотя аутореактивные клетки являются неизбежным продуктом процессов случайной перестройки генов, которые приводят к разнообразному репертуару рецепторов лимфоцитов. Эта самотолерантность поддерживается клональной делецией или замалчиванием. Развивающиеся лимфоциты, которые сталкиваются с аутоантигенами в месте развития лимфоцитов, устраняются или функционально подавляются на ранней стадии.Если аутореактивная клетка сталкивается со своим аутоантигеном после созревания, клетка, как правило, остается инактивированной из-за дополнительной потребности в костимулирующем сигнале. Поскольку ГАГ могут связываться со многими типами рецепторов клеточной поверхности, а также с цитокинами и другими растворимыми белковыми мессенджерами (8–12), а также потому, что полисахариды способны сшивать множество рецепторов на одной или нескольких клетках (35), GAG могут действовать как «суперантигены» и обеспечивать необходимые сигналы, способствующие росту GAG-связывающих клеток.Кроме того, нерегулярные количества высококислотных и многомолекулярных ГАГ могут изменить микроокружение и динамику иммунной системы. GAG могут регулировать гематопоэтические факторы роста, которые способствуют производству GAG-связывающих клеток. Мы предполагаем, что развитие болезни происходит из-за внутренней аномалии клеточного гомеостаза, вызванной GAG, а не только вследствие распознавания антигена GAG-связывающими клетками в соединительных тканях.

Наши наблюдения имеют потенциальное значение для фундаментального понимания артрита и, возможно, других ревматических заболеваний и заболеваний соединительной ткани, если аберрантные иммунные ответы на ГАГ действительно связаны с этими состояниями.ГАГ являются атипичными углеводными аутоантигенами по сравнению с «классическими» пептидными или белковыми антигенами. То, как иммунная система обрабатывает углеводы, в настоящее время плохо изучено и может иметь недооцененное значение. Понимание того, как иммунизация против аутоантигенов, таких как ГАГ, изменяет иммунную систему и вызывает системные хронические заболевания у мышей, может помочь заполнить этот пробел в наших знаниях. Самоантигенные ГАГ, корреляция активности клеток in vitro, и распространенности заболевания, и наша модель in vivo могут служить модельной системой для открытия и разработки лекарств против аутоиммунных заболеваний соединительной ткани.Связывание GAG можно использовать в качестве метода обнаружения клеток, которые могут быть коррелированы или действительно вызывать RA и другие заболевания соединительной ткани. Наконец, ингибирование аномального роста или адгезии иммунных клеток, реактивных к ГАГ, может открыть новые терапевтические возможности для лечения РА и связанных с ним заболеваний.

Благодарности

Мы благодарим профессора Арне Луза и доктора Родерика Бронсона за гистопатологические советы, Ли Чжан, Аманду Л. Ганонг и Ён-Хун Чой за техническую помощь, доктораКарен Абуди за доступ к ее флуоресцентному микроскопу и доктору Янине Лонгтин, отделение патологии, Бригам энд Женская больница, за образцы тканей человека. M.H.R. посвящает эту работу памяти своего покойного отца, доктора Майкла А. Рорла.

Сокращения

• РА, ревматоидный артрит

• CSA, хондроитинсульфат A

• CSB, хондроитинсульфат B

• CSC, хондроитинсульфат C

• ГАГ, гликозаминогликан

• HA, гиалуроновая кислота

• HP, гепарин

• Поделиться